Нет сомнений, что преемственность явлений и организации жизни возможна только потому, что организованная живая материя обладает способностью к размножению.
Однако в явлении размножения следует различать два существенно различных процесса. Организм в целом, начиная с оплодотворенного яйца, воспроизводится путем сложного развития, при котором многие его свойства являются результатом качественных превращений в процессе индивидуального развития.
Воспроизведение наследственных структур осуществляется особым путем, получившим название авторепродукции (процесс, позволяющий с максимальной точностью воспроизводить все особенности молекул, составляющих материальные основы наследственности).
Н. К. Кольцов выдвинул идею, что хромосомы представляют собой макромолекулы, полагая, что генетической основой хромосомы является белок и что удвоение хромосом происходит путем автокатализа — процесса, сходного с кристаллообразованием.
Термин «автокатализ» заимствован из химии по аналогии с типами реакций, обусловленных катализаторами. В том случае, когда вещество выступает в качестве катализатора реакции, ведущей к его собственному появлению, реакция называется автокатализом. Понятие «автокатализ» является синонимом саморазмножения и самоудвоения.
Исходя из представления, что специфичность генов обусловлена их белковой природой, Паулинг и Дельбрюк выдвинули гипотезу, по которой удвоение генов осуществляется тем же путем, каким появляются антитела под действием антигенов. Эта гипотеза была поддержана Эмерсоном, Райтом и другими исследователями.
Сущность гипотезы автокатализа состоит в том, что исходные наследственные молекулярные структуры выступают в качестве модели, которая черпает из окружающей ее внутриклеточной среды материал для создания таких же структур путем одноступенчатой реакции автокатализа.
Однако в течение последнего десятилетия стало окончательно ясно, что генетическая специфичность организмов в первую очередь связана с ДНК.
Гауровиц выступил с идеей о роли ДНК в развертывании полипептидных цепей. Однако и эта идея не принимала во внимание генетической роли ДНК. Кроме того, представления об автокатализе белков не получили конкретного химического истолкования.
Впервые концепция об удвоении наследственных структур стала понятной в терминах атомов и молекул благодаря гипотезе, предложенной Уотсоном и Криком, о самоудвоении молекул ДНК.
Центральным событием в делении клетки является появление двух новых хромосом там, где была одна. В вопросе о том, как осуществляется удвоение хромосом клетки и удвоение частиц вирусов, сосредоточены главные проблемы материальных основ наследственности и жизни.
Как показано выше, ДНК состоит из двух взаимодополняющих цепей полинуклеотидов. Водородные связи, связывающие две цепи, слабые, их энергия не превышает энергию теплового движения при комнатной температуре. Укажем, например, что водородные связи — это те основные силы, которые объединяют молекулы воды, благодаря чему вода при комнатной температуре представляет собой жидкость, а не газ. Через нарушение водородных связей двойная структура ДНК сравнительно легко может разделиться на две одинарные нити. Освобожденные связи являются точками притяжения свободных нуклеотидов или их предшественников из протоплазмы. Нуклеотиды, притягиваясь к цепи, связываются, создавая специфические пары оснований (аденин — тимин и гуанин — цитозин). Каждый из нуклеотидов присоединяется своим основанием к одному из оснований в одинарной цепи полинуклеотидов. Так постепенно рядом с одинарной цепью полинуклеотидов возникает основа второй дополнительной цепи. Затем образуются связи между сахаром и фосфатом, создающие скелетную основу для второй новой цепи. Так как при создании второй цепи притягивающиеся нуклеотиды создают специфические пары оснований, в новой цепи последовательность пар оснований в точности воспроизводит комплементарную последовательность, характеризовавшую старую цепь, восстанавливая исходную структуру ДНК (рис. 64).
Гипотеза удвоения ДНК исключительно проста и химически обоснована.
Важнейшим событием в биохимическом обосновании теории самоудвоения молекул ДНК было открытие и выделение Корнбергом специального фермента — полимеразы, которая синтезирует полимерные молекулы ДНК. Однако, если составить смесь из всех четырех нуклеотидов в бактериальном экстракте, очищенном от ДНК, синтез ДНК не происходит. Корнберг показал, что для синтеза ДНК необходимо некоторое количество «затравки» в виде некоторого количества ДНК. Только отталкиваясь от готовой матрицы, может идти реакция образования новой ДНК. Опыты показали, что бактериальная полимераза не обладает видовой специфичностью, ее действие универсально.
Эти опыты поставили важнейший вопрос: что определяет специфику синтезируемой ДНК, свойства полимеразы или качество затравочных молекул ДНК? Эксперимент дал совершенно точный ответ. Оказалось, что в пробирке, вне живого организма, химический состав вновь синтезируемых нуклеиновых кислот полностью соответствует качеству молекул ДНК —«затравки».
ДНК представляет собой двойную спиральную молекулу. Для начала синтеза ДНК она должна раскрутиться с появлением одиночных цепей полинуклеотидов, которые и служат матрицей, присоединяющей нуклеотиды из цитоплазмы. Корнберг показал, что в клетке существует специальный фермент, обеспечивающий раскручивание двуспиральной ДНК.
Нагревание ведет к денатурации молекул ДНК, к ее распадению на однотяжевые (одноцепотчатые) структуры. После такой обработки синтез, молекул ДНК шел наиболее интенсивно.
Левинтал и Томас впервые провели экспериментальное исследование природы механизма удвоения ДНК вирусов с помощью меченых атомов и представили серьезные данные в пользу реальности исходной модели Уотсона и Крика (рис. 65).
Введение в молекулу ДНК радиоактивного изотопа 32Р позволяет решать вопрос о том, как будут распределяться атомы ДНК среди молекул, образуемых при появлении новых хромосом. Можно указать на три основных возможных пути удвоения наследственных структур (рис. 66).
Первый из них — это копирование без нарушения исходного шаблона, или так называемая консервативная авторедупликация. В этом случае все меченые атомы, бывшие в исходной молекуле, переходят к одной из дочерних молекул, а вторая дочерняя молекула совсем их не имеет (рис. 66, I).
Второй тип — дисперсивное удвоение. В этом случае исходная молекула метится 32Р и затем при разделении ее материала количество меченых атомов должно уменьшаться вполовину, это должно повторяться при каждой репликации так, что в конце концов каждая молекула ДНК будет нести очень малое количество атомов меченого фосфора (рис. 66, II).
Третий тип авторепродукции — это тип комплементарного полуконсервативного удвоения, предложенный Уотсоном и Криком (рис. 66, III). В этом случае если меченые атомы присутствуют в обеих субъединицах исходной молекулы, то при удвоении они разъединяются и каждая строит комплементарную немеченую нить. Во второй авторепродукции половина молекул оказывается с меткой и половина без метки. Во всех последующих поколениях растет количество немеченых молекул, и в конце концов сохраняются лишь две меченые молекулы, которые имеют субнить в виде половины меченой исходной молекулы. Этот тип репликации получил название полуконсервативной авторедупликации.
Левинтал и Томас фиксировали β-излучения от введенных в частицы ДНК фага атомов 32Р. Они показали, что атомы радиоактивного изотопа не распыляются среди громадного количества новых частиц, образующихся при размножении; напротив, в основном они передаются связанными группами, следуя за сохраняющейся структурой исходной молекулы. Полученные факты явились экспериментальным свидетельством в пользу правильности основной модели размножения ДНК, по Уотсону и Крику, согласно которой исходная двойная структура ДНК разделяется на две цепи, а дальнейший автокатализ идет на основе привлечения предшественников из протоплазмы с сохранением самостоятельности каждого образца, по которому идет автокатализ.
Сталь и Мезельсон, используя введение в молекулы ДНК тяжелого азота (15N), дали прямые доказательства правильности идеи о полуконсервативном механизме авторепродукции генетического материала.
Один из стабильных (нерадиоактивных) изотопов азота обладает добавочным нейтроном в ядре, поэтому его атомный вес равен 15. Это так называемый тяжелый азот. При выращивании многих поколений бактерий на среде, где единственным источником азота были ионы тяжелого нитрата 15NO3, 14N во всех основаниях ДНК был заменен на 15N.
Вес молекулы ДНК изменяется при наличии в ней тяжелого азота. При ультрацентрифугировании в градиенте плотности происходит перераспределение молекул ДНК по их плотности. Наибольшую плотность имеют молекулы ДНК, которые содержат 15N во всех основаниях (15N в обеих цепях полинуклеотидов); эта плотность становится средней для «гибридных» молекул, имеющих в одной цепи 15N, а в другой — 14N, и наименьшей для молекул с 14N в обеих цепях.
На рисунке 67 показан ход опыта, когда прослеживалась судьба полинуклеотидов из клеток кишечной палочки, у которых все основания в ДНК имели тяжелый азот 15N. Здесь представлена ДНК из родительской клетки, у которой все основания имеют тяжелый азот 15N. Эти бактерии помещались в питательную среду, содержащую только 14N. При первом делении бактериальных клеток авторепродукция молекул ДНК по матрицам в виде отдельных полинуклеотидных цепей должна была привести к появлению «гибридных» молекул. У таких молекул одна цепь (родительская) вся целиком должна состоять из оснований с тяжелым азотом 15N, а другая, новая, синтезированная из веществ, лишенных тяжелого азота, должна быть целиком построена из оснований с обычным азотом 14N. Такие «гибридные» молекулы с половинным весом действительно были обнаружены в первом поколении от исходных клеток (рис. 67, б). При получении второго поколения следовало ожидать дальнейшего уменьшения количества тяжелого азота. В целом количество 15N во втором поколении упало до 0,25 всего азота в клетках. Однако его распределение было очень своеобразно. Во втором
поколении половина молекул оказалась полностью свободной от тяжелого азота, а вторая половина содержала молекулы «гибридной» ДНК, в которых в одной нити полинуклеотида находился тяжелый азот 15N, а в другой нити полинуклеотида — обычный азот 14N. Это свидетельствует о том, что нить ДНК переходит из поколения в поколение целиком (судя по метке 15N) и является матрицей при синтезе комплементарной цепи полинуклеотида, возникающей на базе авторепродукции молекулы.
Анализ природы авторепродукции ДНК получил новое развитие при анализе самоудвоения молекул в искусственных условиях в пробирке (in vitro).
Показано, что нагревание до 80—90° С раствора нуклеиновых кислот, выделенных из частиц вируса или из клеток, вызывает распад молекулы ДНК на две отдельные составляющие ее полинуклеотидные цепи. Этот процесс, как и всякий другой, когда структура теряет свой естественный, природный, или, как говорят, нативный, характер, носит название процесса денатурации. Таким образом, влияние повышенной температуры вызывает денатурацию молекул ДНК. Если смесь денатурированной ДНК, состоящую из одноцепотчатых полинуклеотидов, медленно, осторожно охлаждать, то полинуклеотиды соединяются и образуют вновь двухцепотчатые молекулы ДНК. В этих условиях наступает процесс ренатурации — восстановления исходной структуры молекулы.
Очень интересно, что комплементарные полинуклеотидные цепи, соединяющиеся друг с другом при ренатурации, могут быть разного происхождения.
Так, при взятии ДНК из клеток одного штамма кишечной палочки, где ее молекулы ДНК во всех основаниях содержат тяжелый азот 15N, и смешении их с молекулами ДНК из другого штамма, имеющими обычный азот 14N, можно получить денатурацию молекул ДНК в условиях повышенной температуры. Таким образом была получена смесь одноцепотчатых полинуклеотидов, содержащих разные изотопы азота. При ренатурации, которая шла в условиях медленного охлаждения смеси, возникли «гибридные» молекулы, у которых одна цепь содержала 15N, а другая — 14N. Эти молекулы, полученные в пробирке, в точности соответствовали «гибридным» молекулам ДНК, которые синтезировались в естественных условиях, при авторепродукции клеток с 15N, воспитанных на среде, содержащей легкий изотоп 14N.
Таким образом, мы видим, что две молекулы ДНК, возникшие через авторепродукцию каждой из двух отдельных цепей полинуклеотидов, входящих в состав этой молекулы, по нуклеотидному составу полностью повторяют исходную родительскую молекулу. Это вполне понятно в свете описанного молекулярного механизма авторепродукции. В этом случае нить полинуклеотида строит рядом с собой дополнительную цепь, полностью повторяющую ту, которая дополняла эту нить в родительской молекуле. Поскольку при авторепродукции порядок оснований повторяется, молекула ДНК полностью сохраняет свойственный ей генетический код. Таким путем наследственная информация получает возможность полноценно, в сохранности передаваться из одной клетки всем ее потомкам и от одного поколения организмов другому.
Мы рассмотрели принципы авторепродукции генетического материала на молекулярном уровне, однако имеется немало указаний, что хромосомы имеют сложное строение. Как же сочетать принципы авторепродукции молекул ДНК со сложной комплексной природой хромосом?
Имеются указания, что в основе генетического строения хромосом лежит не одна нить ДНК. Так, Кауфман впервые указал, что хромосомы сразу же после их разделения, т. е. уже в анафазе, могут состоять из двух нитей. Небел и Кувада обосновали версию, что каждая из субнитей в анафазе подразделяется еще на две дочерние субнити. Грелл наблюдал, что у некоторых москитов в ранней профазе хромосома представлена одной видимой нитью, а затем становятся видны 16 и даже 32 нити.
Мэнтон, используя ультрафиолетовую фотографию, получил доказательство, что у папоротника анафазные хромосомы содержат четыре нити. Подавляя меркаптанолом митоз в яйцах морских ежей, Мэзия показал, что здесь хромосомы в профазе содержат по крайней мере 4 нити.
Использование электронного микроскопа показало сложность строения хромосомы. При высоких разрешающих способностях электронного микроскопа хромосома предстала в виде сложной многонитчатой фибриллярной структуры. Рисе изучил хромосомы — «ламповые щетки» разных амфибий, а также пахитенные хромосомы целого ряда насекомых и растений и лептотенные хромосомы лилейных. Он заключил, что все эти хромосомы типа профазных содержат фибриллы. Дальнейший анализ привел к заключению, что единицей структуры хромосом является нить в 40 Å шириной, которая содержит одну молекулу ДНК и гистона.
Обобщением из всех этих наблюдений было признание целой иерархии нитей в структуре хромосомы высших форм.
Электронномикроскопическое исследование низших форм также обнаружило сложную структуру их «хромосом». Маршак обнаружил, что хромосомы бактерий содержат 4 нити по 250 Å шириной. Келленбергер исследовал хромосомы Е. coli и нашел, что они многонитчаты, состоят из фибрилл 20—60 Å толщины, каждая из которых представляет собой молекулу ДНК. Однако все эти морфологические наблюдения оказываются в противоречии с данными об авторепродукции хромосом, полученных с помощью радиоактивной метки и другими способами.
Так, например, морфологические наблюдения указывали, что структура особых хромосом амфибий, получивших название «ламповых» щеток, имеет сложный характер. Однако Галл, исходя из данных о скорости, с которой действует дезоксирибонуклеаза, подсчитал, что вся хромосома состоит из одной молекулы ДНК.
Тэйлор, Вудс и Хьюджес помещали проростки конских бобов на некоторое время в раствор, содержащий 3Н-тимидин, а затем в среду без метки. Затем в разное время обработки проростки фиксировались и изучались как цитологически, так и авторадиоавтографически. После первого синтеза, прошедшего в присутствии метки, в первой метафазе все хроматиды оказались мечеными, во втором митозе половина хроматид была с меткой, другая половина свободной от метки (рис. 68).
Такой результат показывает, что интерфазная хромосома содержала одну нить молекулы ДНК с двумя самоудваивающимися полинуклеотидными цепями. Картина авторепродукции
имеет характер типичного полуконсервативного удвоения. После этой работы на клетках растений и животных неоднократно было показано наличие полуконсервативного типа авторедупликации хромосом.
Авторадиографические исследования по авторепродукции хромосом у Е. coli показали, что их основа состоит из молекулы ДНК. Противоречия между данными по авторепродукции хромосом и по анализу их морфологии вызвали к жизни ряд гипотез, которые попытались ответить обеим категориям фактов. Богданов и Иорданский предложили гипотезу, согласно которой целый ряд нитей объединяются в плоскую структуру и при авторепродукции хромосом ведут себя как целое. Однако многонитчатая структура хромосом находится в противоречии не только с данными по авторепродукции. Приняв такую модель хромосомы, мы встанем перед очень трудными задачами в области мутагенеза.
Известно, что хромосома и хроматида при мутациях генов в основном ведут себя как одна нить ДНК. Современную молекулярную теорию нельзя согласовать с идеей о многонитчатом строении хромосомы. То же касается механизма кроссинговера, понимание которого в последнее время все более и более приближается к молекулярному уровню.
Однако, если принять, что основой хромосом служит длинная молекула ДНК, нелегко объяснить морфологические многонитчатые хромосомы. Вопрос стоит так: как упакована эта одна нить, при морфологическом анализе хромосомы она бы смогла выглядеть многонитчатой?
У многих организмов хромосомы содержат такое количество ДНК, что при их раскручивании длина оси хромосомы должна составить а метров. Левинтал и Крайн подсчитали, что такая спираль не может развернуться и удвоиться без разрывов. Лонгвен-Хигинс и Цим предположили, что в этом случае должно быть несколько независимых единиц вдоль по оси
хромосомы. Бидих и Розенкранц показали, что ДНК из спермы содержит один фосфосериновый остаток на 1000 нуклеотид. Тейлор предположил, что нуклеозидные концы цепей ДНК соседних молекул могут быть связаны этими остатками молекул. Фриз предположил, что для модели, удовлетворяющей задачам раскручивания длинной молекулы, следует признать наличие связи отдельных молекул ДНК по одной из полинуклеотидных цепей. Эта модель отвечала данным Тейлора о полуконсервативном типе авторедупликации и о наличии обменов между сестринскими нитями. Эта модель отвечала также данным о рекомбинациях и о мутациях. Изменение формы и длины хромосом на разных стадиях клеточного цикла связано с разными степенями спирализации основной оси хромосомы.
Тейлор несколько видоизменил концепцию Фриза. Он выдвинул идею о наличии двух типов связей, которыми объединяются соседние молекулы ДНК. Одна связь (рис. 69) концевых нуклеозидов по углероду в позиции 3′ и вторая связь по углероду в позиции 5′. Наконец, Тейлор допускает еще наличие Н-связи, которая обеспечивает образование третичной структуры хромосом, возникающей во время метафазы и анафазы.
—Источник—
Дубинин, Н.П. Горизонты генетики/ Н.П. Дубинин. – М.: Просвещение, 1970.- 560 с.
Предыдущая глава ::: К содержанию ::: Следующая глава
