В результате бурного развития молекулярной биологии и молекулярной генетики, расширения экспериментальных возможностей манипулирования с генетическим материалом появилась возможность такого экспериментального вмешательства, которое позволяет осуществлять направленное изменение генома, не прибегая к традиционным методам скрещивания или вызывания мутаций. Родилось новое направление — генетическая инженерия, задача которой состоит в получении индивидуальных генов или изолированных генетических структур и введении их в новое генетическое окружение с целью создания организмов с новыми, заранее предопределенными признаками. Иными словами, задача генетической инженерии заключается не в изменении уже имеющихся в клетке генов, а во введении в них новых, отсутствовавших ранее генов.
Существуют несколько способов получения отдельных генов или их объединений:
1) контролируемая фрагментация генома, разделение фрагментов и их идентификация;
2) выделение индивидуальных оперонов из трансдуцирующих фагов, содержащих одинаковые бактериальные гены;
3) химический синтез;
4) биохимический (ферментативный) синтез.
Получение генов посредством контролируемой фрагментации генома наибольшее применение получило в экспериментах по выделению бактериальных генов благодаря тому, что отдельные фрагменты ДНК можно идентифицировать в опытах по генетической трансформации. Фрагментацию генома проводят либо механически, либо с помощью специальных ферментов — рестрикционных эндонуклеаз. Известно множество этих ферментов, но каждый из них обладает большой специфичностью к узнаваемой им последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Такие ферменты узнают последовательности протяженностью в 4 и 6 пар нуклеотидов и разрезают молекулу в этом месте, оставляя концы либо тупыми, либо с небольшими в 3—4 нуклеотида, однонитевыми участками («липкими концами»). Поскольку такого рода последовательности могут быть в любой по происхождению ДНК, очевидно, что характер разрезания, «рестрикции» различных ДНК будет одинаков. При рестрикции или механическом дроблении ДНК ген может оказаться структурно нарушенным. Поэтому целостность его обязательно следует проверить по наличию функции в опыте по трансформации. Если функция гена сохранена, приступают к его выделению и последующему использованию. Необходимо отметить, что получаемые таким образом фрагменты ДНК часто могут содержать несколько близлежащих генов вместо одного искомого, однако даже такое обогащение по одному гену можно считать успехом.
Выделение индивидуальных оперонов из трансдуцирующих бактериофагов описано Дж. Беквитсом, использовавшим два разных бактериофага кишечной палочки, несущих лактозный оперон этой бактерии. Поскольку фаги разные, то естественно, последовательность оснований в молекулах их ДНК различна и единственным общим участком у обоих фагов является бактериальный оперон. Основываясь на этом, из взятых фагов была выделена ДНК, затем разделили ее нити и смешали идентичные нити ДНК двух фагов. Поскольку гомологичными были последовательности только в области лактозного оперона, то именно в этой области прошла гибридизация с образованием двунитевой структуры, остальные участки фагового генома остались несгибридизовавшимися, их убрали специальной нуклеазой, гидролизующей однонитевую ДНК. Таким образом, был получен в чистом виде бактериальный оперон с регуляторными областями и всеми структурными генами. Данный метод применим и для других оперонов при наличии соответствующих трансдуцирующих бактериофагов. Правда, получение таких фагов представляет собой довольно трудную, но вполне разрешимую задачу.
Химический синтез гена разработан индийским ученым Хораной, им же синтезирован первый ген. Это был ген аланиновой тРНК дрожжей, состоящий всего из 77 пар нуклеотидов. Разумеется, синтезировать таким образом можно" такой ген, последовательность нуклеотидов в котором уже определена, или же которую можно составить из последовательности аминокислот в молекуле белка синтезируемого этим геном, если такая последовательность известна. Десять лет понадобилось лаборатории Хораны, чтобы синтезировать функционально активный ген. Им также оказался ген транспортной РНК — супрессорной тирозиновой тРНК кишечной палочки. Его структурная часть состоит из 126 пар нуклеотидов. К ней примыкает промоторно-операторная область из 52 пар нуклеотидов и терминаторный участок из 21 пары нуклеотидов (всего 199 пар нуклеотидов). Этим методом уже синтезировано несколько генов транспортных РНК, ген-оператор лактозного оперона кишечной палочки, гены некоторых пептидных гормонов.
Биохимический, или ферментативный, синтез генов стал возможен после открытия фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, способного синтезировать молекулы однонитевой ДНК, используя в качестве матрицы молекулы мРНК. Поскольку такой фермент может вести синтез только с двуспиральных участковое молекулы мРНК, как известно, имеют на одном из концов полиА-последовательность, то в бесклеточную систему с четырьмя нуклеотидтрифосфатами, мРНК и ферментом добавляют затравку в виде политимидиловой кислоты. Последняя создает двунитевую структуру с полиАтпоследовательностью, чём обеспечивает начало работы фермента. РНК-зависимая ДНК-полимераза синтезирует одну из нитей, на которой затем с помощью ДНК-зависимой ДНК-полимеразы можно синтезировать вторую нить ДНК. Ферментативным путем в настоящее время синтезированы многие гены, в том числе гены глобина (белковой части гемоглобина) мыши, крысы, кролика, человека, курицы, гены инсулина рыбы и человека, гены отдельных цепей иммуноглобулина (белка, обеспечивающего иммунные реакции организма), человеческого интерферона, гены запасных белков кукурузы (зеина), сои (глицинина), гороха (легумина), фасоли (фазеолина) и др.
Следуя второй задаче генной инженерии полученные одним из описанных методов гены необходимо ввести в клетки, в которых этих генов раньше не было. Для большей эффективности введения в клетки чужеродных генов используют специальные молекулы, названные векторами, в которые эти гены встраивают. Молекулы ДНК, претендующие на роль векторов, должны соответствовать следующим основным требованиям: 1) небольшие размеры; 2) большое число копий на клетку; 3) простота выделения; 4) наличие уникальных (единичных) сайтов рестрикции для нескольких эндонуклеаз; 5) наличие селективных маркёров для отбора трансформантов. В наибольшей степени этим требованиям соответствуют некоторые бактериальные плазмиды, а также специальные мутанты некоторых умеренных фагов.
Дли введения синтезированного каким-либо способом гена, фрагмента ДНК, полученного путем механического дробления ДНК, или гена, выделенного по Беквитсу, вектор разрезается одной из эндонуклеаз с уникальным сайтом, рестрикции, затем к вектору и гену пришиваются с помощью фермента концевой трансферазы комплементарные гомополимерные последовательности (например, полиА и полиТ или полиЦ и полиГ). Полученные компоненты смешивают, обрабатывают полинуклеотидлигазой и созданной таким образом молекулой рекомбинантной ДНК трансформируют реципиентные клетки. Для введения в вектор гена или фрагмента ДНК, полученного в результате рестрикционного фрагментирования генома, вектор обрабатывают той же эндонуклеазой, что и донорную ДНК, затем продукты смешивают друг с другом, обрабатывают полинуклеотидлигазой и трансформируют реципиентные клетки. Отбор трансформантов проводят либо по встроенному гену, если он может служить генетическим маркером, либо по тому и другому. Выросшие при этом трансформанты называют клонами, а саму процедуру часто называют молекулярным клонированием ДНК. Конечно, техника молекулярного клонирования наиболее полно разработана пока что для бактерий и то немногих. Основными моделями генетической инженерии в настоящее время являются кишечная и сенная палочки. Постепенно к ним начинают приобщаться некоторые другие бактерии и дрожжи, а также клетки растений и млекопитающих в культуре. Причин отставания многоклеточных организмов много: и более сложная их организация, и меньшая изученность, и в связи с этим отсутствие надежных векторов для введения генов. Одним из кандидатов в векторы для клеток человека считается обезьяний вакуолизирующий вирус 40 (ОВ40), на котором уже проводятся успешные работы по клонированию ДНК. Кандидатами в векторы для растений считают плазмиду, вызывающую корончатые галлы у растений, а также ДНК-содержащий вирус мозаики цветной капусты.
Однако перенос генов возможен и безвекторным способом. В частности, представляют интерес данные, полученные в результате слияния протопластов (клеток, лишенных оболочек) различных видов растений. Вследствие такого слияния происходит полное объединение генетического материала обеих клеток и не только геномного, но и пластомного (находящегося в составе пластид, митохондрий и др.), чего не удается достичь при обыкновенном скрещивании.
Большой интерес представляют работы по использованию умеренных фагов и некоторых вирусов в качестве носителей определенных генов. Так, бактериофаги кишечной палочки, несущие лактозный или галактозный оперон, были использованы для введения последних в клетки человека и растений. Есть достаточно оснований считать, что бактериальные гены могут фенотипически выражаться в клетках многоклеточных организмов.
Задачи, стоящие перед генетической инженерией, носят в основном прикладной характер. Их можно классифицировать следующим образом:
1) создание новых рас микроорганизмов с измененным качеством и увеличенным количеством производимого ими ценного продукта;
2) клонирование в микроорганизмах участков геномов или индивидуальных генов животных и человека с целью производства в микробной клетке особо ценных препаратов;
3) клонирование в микроорганизмах генов, кодирующих вирусные и микробные антигены, противоопухолевые антигены и интерфероны для обеспечения их промышленного производства микробиологическим путем;
4) генетическая модификация высших растений для увеличения их продуктивности и улучшения качества создаваемых ими продуктов;
5) клонирование генов, необходимых для исправления наследственных дефектов человека.
—Источник—
Богданова, Т.Л. Справочник по биологии/ Т.Л. Богданова [и д.р.]. – К.: Наукова думка, 1985.- 585 с.
Предыдущая глава ::: К содержанию ::: Следующая глава
