big-archive.ru

Большой информационный архив

                       

Проблема гена, физические и химические основы дискретности и непрерывности хромосом. Заключение

Теперь мы уже в состоянии ответить на вопрос, что такое ген, опираясь на знание его физических и химических основ, на уровне групп атомов и большой молекулы ДНК. Ген — это участок цепочки молекулы ДНК, состоящий примерно из 1000 нуклеотидов и выделенный с обеих сторон пунктуацией в виде группы неактивных нуклеотидов. Благодаря этому ген обладает способностью к авторепродукции и, кроме того, к отдельной транскрипции. При транскрипции генетическая информация гена перекодируется на молекулы и-РНК по всем основаниям и всем триплетам, которые входят в состав гена. На рисунке 92 мы видим, как ген, в данном случае представленный в молекуле ДНК отрезком полинуклеотидной цепи, перекодировал свою генетическую информацию в одноцепотчатую молекулу и-РНК, которая затем включается в рибосому. Находясь на рибосоме, ген, представленный уже в транскрибированной форме, готов к осуществлению функции трансляции, т. е. к постройке молекул белка.

Однако, чтобы функция трансляции гена на синтез белка могла быть осуществлена, необходима подготовка и доставка аминокислот к рибосоме, ибо трансляция выражается в том, что готовые аминокислоты в определенном порядке связываются в полипептидные цепи белка.

Хохленд впервые указал, как особая транспортная РНК (т-РНК), доставляющая аминокислоты к рибосомам, объединяется с аминокислотами. В клетке было обнаружено 20 разных специфических ферментов (аминоацилы-РНК-синтетазы), активирующих 20 разных аминокислот. Такие активированные аминокислоты присоединяются к аденину концевого участка т-РНК, образуя 20 разных комплексов аминоацил — т-РНК. Механизм распознавания отдельных активированных аминокислот, соответствующих т-РНК, еще не ясен. Важнейшим моментом в синтезе полипептидов является то, что место включения данной аминокислоты в полипептид определяется не спецификой аминокислоты. Кодоны и-РНК не обладают способностью распознавать разные аминокислоты.

Оказалось, что это относится не к специфике аминокислоты, а к специфике той т-РНК, которая доставила данную аминокислоту к рибосоме. За способность быть узнанной соответствующим кодоном и-РНК соответствующие т-РНК получили название антикодонов. Вполне понятно, что в клетке имеется 20 антикодонов.

Существование антикодонов было доказано в следующем эксперименте. Доставка активированного цистеина и активированного аланина осуществляется соответствующими молекулами т-РНК. Кодоном для включения в белок цистеина служит триплет УУГ, Для аланина — ЦЦГ и УЦГ. В комплексе цистеин — т-РНК, удаляя серу из цистеина, удалось превратить его в аланин, сохранив этот аланин на т-РНК, свойственной цистеину. Как будет включаться этот необычайный комплекс из аланина, и т-РНК, специфичный для цистеина, что для этого комплекса будет кодоном в молекуле

Схема генетической детерминации механизма синтеза белка

и-РНК, кодоны аланина — ЦУГ или УЦГ или кодон цистеина УУГ? Если кодон определяет «распознавание» аминокислоты, тогда этими кодонами будут ЦЦГ и УЦГ, а если т-РНК, то УУГ. Опыт показал (рис. 93), что кодон и-РНК не «распознает» аминокислоту, в этом случае все решает антикодон, представленный специфической молекулой т-РНК.

Таким образом, вся специфика механизма синтеза белка ограничена кругом нуклеиновых кислот — ДНК (ген) → и-РНК (транскрибированный ген) → т-РНК (антикодон). Задача распознавания специфики аминокислот падает на антикодоны. Само включение аминокислоты в полипептидную цепь основано на «распознавании» антикодона кодоном, представленным в молекуле и-РНК (рис. 93).

Важнейшим вопросом в проблеме гена является его отношение к двуспиральной молекуле ДНК. Ген транскрибируется в виде одноцепотчатой и-РНК, которая воспринимает его генетическую информацию, однако молекула ДНК на данном участке составлена из двух полинуклеотидных цепей. В каком же отношении транскрибированный одноцепотчатый ген в виде молекулы и-РНК находится к двум цепочкам полинуклеотидов в молекуле ДНК? Здесь возможны три типа транскрипции: а) обе комплементарные нити молекулы ДНК являются геном, транскрибируясь в виде двух молекул и-РНК; б) транскрибированный ген формируется путем перехода в одну молекулу и-РНК разных участков с обеих комплементарных нитей ДНК; в) транскрипция гена происходит только с одной из полинуклеотидных цепей в двойной молекуле ДНК.

Мармур и сотрудники, используя в своих опытах бактериограф

Схема опыта, доказывающего, что спецефичность комплекса аминокислот с транспортной РНК не зависит от аминокислоты, а определяется антикодоном в т-РНК

Bacillus subtilis P8, четко показали, что транскрипция гена происходит с одной нити в молекуле ДНК. ДНК этого бактериофага отличается уникальными свойствами, ее нити отличаются по содержанию в них пуринов и пиримидинов, одна из них тяжелее другой. Это позволяет отличить обе нити в градиентном центрифугировании и разделить их хроматографически на колонки с метилированным альбумином.

Ранее на ряде объектов было показано, что молекула и-РНК обладает способностью объединяться с комплементарной нитью ДНК, давая так называемые гибридные ДНК-РНК молекулы. Ясно, что если транскрипция идет с одной нитью ДНК, то соответствующие молекулы и-РНК окажутся способными давать гибридные молекулы только с одной комплементарной нитью ДНК. Опыты, проведенные на бактериофаге Р8, дали четкий ответ на этот вопрос. В опыте и-РНК фага Р8 отдельно смешивалась с «пуриновой» и отдельно с «пиримидиновой» нитью ДНК этого фага. Оказалось, что выделенная из инфицированных клеток бактерий и-РНК формировала гибридный комплекс лишь с одной нитью ДНК фага, а именно с той, которая содержала большое количество пиримидиновых оснований. Это доказало, что транскрибирование гена', ведущее к синтезу его и-РНК, осуществляется лишь на одной нити ДНК.

Аналогичный результат получен при анализе структуры и-РНК, синтезированной в клетках Е. coli при их заражении фагом Т4 и фагом φХ174.

Возможность выделения индивидуальных и-РНК открывает путь прямого химического анализа индивидуальных генов. При таком выделении мы получаем химически чистый индивидуальный ген, хотя и в транскрибированном виде. В принципе не составляет труда, изучая последовательность в нем азотистых оснований, определить эту последовательность в комплементарной ему нити в молекуле ДНК.

Известно, что, когда ген начинает функционировать, он может делать это непрерывно, и притом с большой скоростью. Средняя продолжительность жизни гена в транскрибированном виде, т. е. в виде молекулы, соответствующей и-РНК, не превышает нескольких минут. Это показывает, что данная и-РНК может транслировать код гена всего лишь на несколько десятков специфически синтезируемых пептидных цепей. Таким образом, очевидно, чтобы образовалось большое количество белка данного типа, ген должен непрерывно поставлять свою информацию, т. е. транскрибироваться в молекулах и-РНК.

В том случае, когда биохимическая последовательность биосинтеза базируется на порядке соседствующих генов, внутри хромосомы возникает особая генная организация, получившая название оперона. Эта особенность широко представлена в хромосомах бактерий. Оперон представляет собой координированную и поляризованную единицу интегральной генной активности. Оперон состоит из нескольких структурных генов, однако координация этих генов такова, что оперон продуцирует только одну единую молекулу и-РНК. Эта и-РНК оперона, соединяясь с рибосомами, образует ряд полипептидных цепей, каждая из которых определяется отдельным геном оперона. Вполне понятно, что функция оперона в целом генотипе бактерий не может быть нерегулируема. Установлено, что для этой цели служат особые гены-регуляторы. Последние осуществляют регуляцию функции оперона через образуемый ими цитоплазматический репрессор.

Репрессор обладает способностью «узнавать» определенную структуру, расположенную на одном из концов оперона, получившую название оператора. Поскольку эта регуляторная связь регулятор — репрессор — оператор — оперон осуществляется через цитоплазматического посредника — репрессора, вполне понятно, что она может поддаваться воздействию различных химических сигналов, исходящих из цитоплазмы или из внешней среды. Эти сигналы могут вызывать активацию или инактивацию репрессора и тем самым могут запускать или, напротив, блокировать процесс транскрибирования оперона в виде соответствующей и-РНК, а следовательно, и синтез соответствующих белков.

На рисунке 94 представлено генетическое строение лактоз-ной области у Е. coli. Использование делеций показало, что оператор расположен вне оперона, он отделен от первого структурного гена определенным участком, получившим название промотора. По-видимому, промотор представляет собой пунктуацию в хромосоме, обеспечивающую начало транскрипции с этого места, или пунктуацию, используемую уже в рибосомах при трансляции. Затем идут координированные системы из трех структурных генов: 1) ген β-галактозидазы; 2) β-галактозидперилазы; 3) β-галактозидтрансацетилазы.

Ген-регулятор вынесен за оператор. В результате образуется и-РНК, однако подразделенная на три области в соответствии с наличием трех структурных генов. Появление этой и-РНК стоит в зависимости от действия гена-регулятора (i) и от взаимодействия репрессора (R) с химическими сигналами из цитоплазмы и внешней среды.

Пример с опероном лактозной области показывает наличие двух основных типов пунктуации в ДНК. Первый тип пунктуации расчленяет ДНК на участки, занимаемые структурными генами, при ее помощи транскрипция ограничивается отдельным геном, что приводит к появлению молекул и-РНК, принимающих на себя генетическую информацию гена. Второй тип пунктуации — это вычленение участков ДНК, занятых координированной системой генов в виде оперона. Для осуществления цепи синтеза генетическая информация целого оперона поступает в виде комплексной и-РНК в рибосомы. Пунктуация, разделяющая структурные гены, целиком сохраняет свое значение внутри оперона.

Таким образом, хромосома содержит в себе в линейном порядке целый ряд единиц в виде цистронов — единиц функциональной активности разных сложностей (рис. 95). Цистрон может входить в опероны разной сложности. У салмонеллы оперон, определяющий синтез гистидина, содержит восемь структурных генов.

Энергия функционирования разных цистронов может быть самой разной в зависимости от участия соответствующих белков в жизни клетки. Возможно, некоторые цистроны работают всего лишь один раз. В других случаях нужна регуляция действия

Генетическая карта lac-области хромосомы E. coli K-12

Генетическая карта кольцевой хромосомы (молекул ДНК) фага Т4

оперона для выработки нужных и подчас значительных количеств соответствующих белков.

Вполне понятно, какое значение имеет знание строения генов и путей регуляции их деятельности для управления жизнью клетки. На этих путях мутагенную селекцию микроорганизмов ждут самые серьезные успехи. Ведь производственные штаммы микроорганизмов отличаются способностью к «сверхсинтезам» веществ, нужных человеку. Создание таких форм со способностью к сверхсинтезу до сих пор происходило путем простого отбора при селекции мутаций, вызываемых действием радиации и химических мутагенов.

Новая теория гена проникает в самую сердцевину понимания механизмов, регулирующих химизм клетки. Скоро настанет время, когда именно новая теория гена, базируясь на сознательном изменении функций цистронов, станет основным рабочим оружием в создании новых форм микроорганизмов. Микробиологическая промышленность пищевых веществ, витаминов, антибиотиков и других ценных веществ получит исключительно эффективные новые научные основы.

Современными исследованиями раскрыта сущность химических преобразований в молекулах ДНК, ведущих к появлению мутаций генов. Мутации генов идут к синтезу мутантных белков или к полной или частичной потере способности синтеза. В первом случае это происходит через изменение механизма включения в полипептидную цепь отдельных аминокислот. Во втором — к потере триплетом его кодового смысла. Вполне понятно, что причиной любого типа мутаций должно служить нарушение кодовой структуры гена через химические преобразования составляющих его нуклеотидов. Например, последовательность нуклеотидов в данном гене при его нормальном функционировании имеет такой вид:

Такой класс мутаций называют «осмысленные» мутации, поскольку химическое изменение в гене не лишило его структуры полноценного кодового смысла. Измененный триплет (в нашем ^примере ААГ-ААА), хотя и кодирует другую аминокислоту, этим нарушая или изменяя нормальную физиологию клетки, однако сам ген не потерял кодового смысла ни для одного из своих триплетов.

Другой класс мутаций, сдвигающий последовательность активации нуклеотидов, ведет к появлению «бессмысленного» кода — триплеты теряют кодовый смысл.

Термин «мутон» в элементарном его смысле означает в приложении к генным мутациям химические изменения на участке молекул ДНК, возникающие за счет замены одного из азотистых оснований на другое. В этом явлении заключен химический смысл всего учения о генных мутациях независимо от того, у какого организма возникает генная мутация.

Согласно классификации Фриза, существуют два основных механизма, вызывающих замену отдельных азотистых оснований внутри гена. Первый механизм состоит в простой замене одного азотистого основания на другое (транзиция). В этом случае пурин замещается пурином, а пиримидин пиримидином. В случае перестановки (трансверсия) пурин может заменяться пиримидином, и наоборот.

Транзиции происходят в силу того, что в цепь ДНК при синтезе молекулы включается необычное основание, а затем на основе этой матрицы идет репликация, ошибки которой дают замену одного исходного азотистого основания на другое, что и завершается появлением мутантной молекулы ДНК.

Трансверсии происходят при ошибках включения во время синтеза молекулы ДНК — пурин вместо пиримидина, и наоборот. Причиной таких ошибок может служить появление таутомерных состояний, при наличии которых может возникнуть связь между пиримидинами и пуринами.

Изменения в действии генов могут возникать и за счет микроструктурных внутригенных преобразований, которые также происходят на уровне изменений в химии гена за счет добавлений или потерь отдельных нуклеотидов.

Известно, что мутагенное действие акридина на фаг состоит в том, что из ДНК фага выпадают или в него вставляются отдельные азотистые основания. Вполне возможно, что природа такого эффекта акридина связана с его включением в одну из нитей ДНК во время синтеза молекулы. Если акридин включается в матричную нить, возникает вставка; при попадании во вновь синтезируемую молекулу ДНК возникает выпадение азотистого основания.

Несмотря на то что вставки и потери касаются отдельных нуклеотидов и в этом отношении, казалось бы, совпадают с истинными генными мутациями, на самом деле они ведут совершенно к другим типам изменений в физиологии гена. Различие состоит в том, что если под влиянием транзиции только тот триплет, в котором заменен нуклеотид, изменяет свой кодовый смысл, то при наличии вставки или потери нуклеотида вся цепь следующих за ними нуклеотидов сдвигается. В результате в белке, синтезируемом под влиянием такого мутантного цистрона, оказывается измененным весь остаток пептидной цепи, контролируемый частью ДНК, находящейся справа от добавленного или потерянного азотистого основания.

Наряду с внутригенными мутациями хромосомы претерпевают структурные изменения, которые связаны с переносом (транслокации), перевертыванием на 180° (инверсии), удвоениями (дупликации) или потерями (делеции) целых блоков генов самой разной длины. Эти изменения в архитектонике нормальных хромосом отражаются на физиологии генов в первую очередь благодаря проявлению эффекта положения генов. Вполне понятны, например, те последствия, которые наступят в действии гена, если в результате хромосомной перестройки какие-либо структурные гены отделятся от своего оператора и присоединятся к чуждому им оперону, управляемому другим оператором.

Ясно, что активность такой перенесенной группы структурных генов окажется в поле действия новой для них системы регуляции. Так, например, Жакобом, Ульманом и Моно у Е. coli была получена делеция, соединившая фрагмент лактозного оперона с фрагментом пуринового оперона (рис. 96). В результате возник новый комплексный оперон, продуцирующий, по-видимому, единую и-РНК, содержащую генетическую информацию для синтеза двух разных типов белков, участвующих в биосинтезе пуринов и лактозы. Однако промотор и оператор для всего этого сложного оперона принадлежит к системе пуринового оперона, и потому возникает совершенно необычная репрессия синтеза белков лактозной области при добавлении в среду пуринов.

Итак, мы видим, что единицей при считывании генетической информации (транскрипции) является кодон, состоящий из трех нуклеотидов. Транскрибируемые молекулы и-РНК в зависимости от степени комплексности оперонов имеют разную длину и сложность. Единицей мутаций служит мутон, элементарные изменения которого касаются отдельных нуклеотидов. Единица рекомбинаций у вирусов и бактерий в элементарной форме также представляет собой нуклеотид.

Делеция, соединяющая фрагмент лактозного оперона с фрагментом пуринового оперона у E. coli

Генетическая карта кольцевой хромосомы (молекулы ДНК) у бактерий Escherichia coli

Встает вопрос: как же осуществляется воспроизведение генов? Способен ли каждый ген к воспроизведению в качестве самостоятельной единицы или репликация генетического материала несет на себе печать какой-либо более высокой организации?

Для ДНК вирусов и бактерий мы, по-видимому, встречаем единства двух главных принципов. Поскольку самоудвоение молекул ДНК обязано последовательному включению в новую полинуклеотидную цепь отдельных нуклеотидов, мы можем признать, что элементарной единицей репликации в этом, да и во всех других случаях, т. е. у всех высших форм, мы должны признать отдельный нуклеотид. Таким образом, казалось бы, что единицей репликации, т. е. репликоном, служит отдельный нуклеотид. Однако это не так. Единицей репликации мы можем

 

 

Простейшая модель репликона

 

признать лишь ту наименьшую часть хромосомы вирусов, бактерий или высших форм, которая, будучи выделенной из хромосомы, способна к авторепродукции. Очевидно, что отдельный нуклеотид не может претендовать на такую роль.

Вопрос о репликоне подвергался специальному анализу в молекулярной генетике вирусов, бактерий и высших форм.

Генетическая информация бактерий записана в молекуле ДНК, которую называют хромосомой. Эта единственная группа сцепления, имеющая замкнутую, или кольцевую форму (рис. 97), состоит из одной двойной цепи ДНК длиной 1,2—1,4 ммк.

Наряду с хромосомой клетка бактерии содержит другой независимый нуклеоид — так называемый F-фактор (фактор, определяющий роль клетки при конъюгации: F+ — донор; F- — реципиент). Согласно Жакобу, Бреннеру и Кузену, кольцевая хромосома бактерий и F-фактор регулируются по отдельности, и при этом каждый из них осуществляет репликацию как целое под влиянием специфических систем регуляции. Регуляция каждого из репликонов осуществляется под действием двух специфических генов. Один из них контролирует синтез инициатора — специфического вещества, активирующего репликацию ДНК. Вторым геном системы репликации является ген-репликатор, т. е. тот локус в репликоне, на который действует инициатор и откуда начинается репликация кольцевой хромосомы (рис.98).

Для того чтобы регуляторная система репликации начала действовать, она должна, кроме того, подчиняться определенной системе, которая в нужное время осуществляла бы ее запуск.

Жакоб, Бреннер и Кузен выдвинули положение, по которому действие сигнальной системы связано с временной фиксацией хромосомы бактерии и нуклеоида F на лизосоме — участке цитоплазматической мембраны. С этой точки зрения, в определенные стадии цикла размножения бактерии с поверхностных структур клетки передается сигнал, который включает систему позитивной регуляции репликации, т. е. сигнализирует структурному гену о начале синтеза вещества-инициатора (рис. 99).

Все это показывает, что клеточная мембрана бактерии, по всей видимости, выполняет часть функций, возложенных у высших организмов на хромосомы. Паван и Тейлор высказали идею

Схема репликации ДНК у бактерий

о том, что хромосома высших состоит из многих единиц репликации.

Изучение систем, регулирующих синтез ДНК, находится в самой начальной фазе своего пути. Однако у бактерий обнаружены единицы репликации, содержащие несколько тысяч генов. Этот факт имеет существенное значение. Система регуляции репликации, так же как и в случае синтеза многих белков, идущего под контролем оперонов, осуществляется благодаря действию на ген продукта, поступающего через цитоплазму. Это включает в систему регуляции возможное влияние цитоплазмы и внешней среды. Регуляция генетических систем у бактерий оказывается исключительно лабильной, и специфичность определяется системой, в основном состоящей из двух генетических элементов. Первый из них — это структурный ген, который под влиянием сигнала, возникающего в определенной фазе развития клетки в лизосоме, начинает синтез своего продукта — вещества-инициатора. Это вещество «узнает» определенную последовательность нуклеотидов в локусе репликатора и запускает с этой точки репликацию всей кольцевой хромосомы.

Мы видим, что старая точка зрения о том, что удвоение генетической информации просто состоит из серии самоудвоений отдельных генов и что как бы мы ни дробили хромосому, ее любые кусочки вплоть до отдельных генов способны к авторепродукции,— в наши дни серьезно пересматривается. Для бактерий показано, что фрагмент хромосомы не авторепродуцируется. Для репликации такой свободный фрагмент должен перейти в интегрированное состояние путем рекомбинаций с одной из системных генетических структур клетки хозяина, т. е. с кольцевой хромосомой или с нуклеоидом F.

Однако все приведенные данные об интегрировании генов внутри разных систем — в опероне при его функции и в репликоне при его авторепродукции — все же, конечно, ни в коем случае не снимают вопроса о реальном существовании гена. Мы уже видели вполне реальный характер существования генов при анализе закономерностей транскрипции генетической информации. Транскрибируемые элементы отдельных генов в виде отдельных молекул и-РНК или входящих отдельными частями в и-РНК оперонов отражают реальное существование генов. Еще более ярко выступает факт существования генов и выделения их как химических индивидуальностей при анализе природы рекомбинаций.

Опыты Хочкиса и Эванса показали, что при трансформации по резистентности бактерий к сульфамиду гены разных размеров внедряются в хромосому реципиента с частотой, обратно пропорциональной величине гена. Чем больше исходная генетическая область, подлежащая быть переданной при трансформации, тем меньше вероятность того, что ее специфичность будет передана в ДНК реципиента.

Очень важны новые данные об экспериментальных возможностях дифференцировки трансформирующей активности ДНК, выделенной из бактерий. Было показано, что под влиянием ультрафиолетового света и температуры в препаратах ДНК трансформирующая активность одних генов инактивируется, а у других остается неповрежденной. Роджер и Хочкис показали, что трансформирующая активность ДНК, выделенной из пневмококков, резистентных к сульфаниламиду, стрептомицину, капаванину, микрокоцину и аминоптерину, инактивируется при разных критических температурах. Так, например, при 88° ещё ни один из перечисленных генов не инактивировался. При 88 инактивировался ген резистентности к микрокоцину, при 95 сразу инактивировались три гена резистентности к сульфаниламиду, стрептомицину, капаванину. Ген резистентности к аминоптерину начинал инактивироваться с 91°.

Если прогретый препарат ДНК со всеми пятью генами пропускать через колонку метилированного альбумина, то как нативные (еще не инактивированные гены при данной температуре), так и денатурированные молекулы ДНК (инактивированные гены) фиксируются на колонке. Наиболее прочно при этом связывается денатурированная ДНК. Используя это обстоятельство с помощью разных концентраций NaCl, можно разделить денатурированную и нативную фракции ДНК. В результате был разработан метод ступенчатого разделения ДНК пневмококка на фракции — гены.

В этих опытах впервые показана возможность избирательной инактивации отдельных генов в трансформирующих препаратах ДНК и направленной трансформации микробов не смесью генов, а путем введения определенных изолированных генов.

В конце 1969 г. Беквитц и другие исследователи использовали способность фагов локализоваться в хромосоме бактерий около отдельного гена. Два разных фага были посажены с двух сторон лаг-оперона у Escherichia coli. Этот участок затем был денатурирован, и после гибридизации отдельные нити ДНК за геном были расщеплены. Они при добавлении нуклеаз были «отъедены». В результате лаг-оперон был выделен в качестве реального изолированного гена.

Все это показывает, что единство непрерывности и дискретности в организации и функционировании хромосом зиждется на существовании реальных генов с их индивидуальной системой азотистых оснований. Однако, слагаясь в систему в пределах хромосомы, гены как части целого подвержены всем регуляторным и обменным процессам, на которых зиждется все значение наследственности для жизни клетки и для процессов развития особи.

 

Предыдущая глава ::: К содержанию ::: Следующая глава

 

                       

  Рейтинг@Mail.ru    

Внимание! При копировании материалов ссылка на авторов книги обязательна.