big-archive.ru

Большой информационный архив

                       

Ядерный контроль при синтезе цитоплазматических белков

Основой жизненных функций клетки является белок. Ферменты, служащие орудием живой клетки, обеспечивающие возможность распада и синтеза органических веществ, также являются белками. Действие ферментов строго специфично. Структура ферментов имеет строго определенный характер, связанный с тем, что боковые группы каждой из аминокислот расположены в определенном порядке вдоль цепи полипептида.

Проблема появления определенных ферментов в клетке является одной из главных для понимания роли материальных основ наследственности.

Глубокий интерес представляет собой то обстоятельство, что главные компоненты хромосом — нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) и белок имеют определенные черты сходства. Они представляют собой гигантские молекулы, основные элементы которых связаны с наличием скелета и боковых групп.

В истории учения о белках в биохимии известное время была принята схема ферментативного синтеза сложных видоспецифических белков; она основывалась на том, что протеолитические ферменты могут производить не только расщепление, гидролиз белка, но и известный синтез продуктов, образовавшихся при его расщеплении. В этом случае имеется в виду образование полипептидов и их последовательное усложнение до белков.

Известно, что в свое время Абдергальден искусственно получил полипептид с молекулярным весом 1246 из остатков 19 аминокислот. Однако известно также, что хотя синтетические высокомолекулярные полипептиды во многом сходны по своим свойствам с нативными белками, однако все же резко отличаются от них. Искусственные полипептиды по мере удлинения их цепи становятся все более инертными, в то время как белок, несмотря на огромную величину своей молекулы, характеризуется чрезвычайной химической активностью.

При всем этом в обычных нормальных физиологических условиях превалирует гидролитическое действие протеолитических ферментов. Было выдвинуто предположение, что синтетический характер действия ферментов регулируется благодаря Адсорбции ферментов, белков и аминокислот на различных структурных элементах протоплазмы (митохондрии, пластиды и т. д.), в силу чего равновесие ферментативной реакции сдвигается в сторону синтеза белка. Учитывая явное влияние нуклеиновых кислот, эта точка зрения отводила им неспецифическую роль, полагая, что богатые энергией дополнительные остатки фосфорной кислоты, содержащиеся в нуклеопротеидах, обеспечивают энергию, нужную для синтеза белков.

Однако вопрос о синтезе сложных видоспецифических белков оказался гораздо сложнее. Первые свидетельства о возможности принципиально особого типа создания таких сложных белков были получены в генетических исследованиях. Данные биохимической генетики показали, что действие генов в клетке в первую очередь связано с появлением ферментов. Это появление ферментов осуществляется в клетке сразу, по-видимому, одним актом, без длинной цепи синтеза. То же относится к появлению антигенов. В этом случае реакции: ген — антиген — антитело, связанные с появлением сложных белков, происходят путем однократных актов, без обычной цепи постепенных синтезов. Эти факты поставили новые проблемы на пути анализа природы синтеза белков.

Кроме того, старая точка зрения не довела, хотя бы в принципе, до ясного понимания сложного механизма синтеза сложных белков. Во-первых, не было получено фактов о синтетическом действии гидролитических ферментов, которое могло бы привести к образованию белков. Во-вторых, хорошо известно, что при 20 исходных аминокислотах количество их сочетаний в цепи, согласно теории сочетаний, равно 2,З∙1018. Кроме того, все аминокислоты, из которых образуются белковые молекулы, оптически активны (кроме глицина). Если принять, что в белковой молекуле содержится только 10 асимметрических атомов углерода, то такая молекула должна иметь число стереоизомеров, равное 1024 (210). Ясно, что любая теория синтеза видоспецифических белков, структура которых полностью повторяется при каждом новом синтезе, должна ответить на вопрос: каким образом из огромного количества возможных сочетаний аминокислот и возможного числа стереоизомеров синтез приводит к появлению данной определенной молекулы белка? В наиболее простой форме вопрос стоит таким образом: как осуществляется организация аминокислот внутри полипептидной цепи, приводящей к их определенному расположению в специфических белках?

Н. К. Кольцов предложил схему, объясняющую механизм автокатализа при синтезе специфических белков. Затем было указано, что для осуществления автокатализа необходимы некоторые условия. Дело в том, что сложные молекулы глобулинов, образуете тесно скрученной пептидной цепью, очень велики; они равны приблизительно 50—100Å. Вместе с тем известно, что внутримолекулярные силы не действуют на расстояние свыше 5—10 Å. Это показывает, что молекула глобулина не может образовываться путем автокатализа. Поэтому было выдвинуто предположение, что воспроизведение белка происходит лишь при том условии, если его молекула вытянута и образует мономолекулярную пленку толщиной менее 10 Å, что составляет величину поперечного диаметра пептидной цепи. Такая развернутая пептидная, пленка может действовать как специфическая адсорбирующая поверхность, на которой каждый из аминокислотных остатков адсорбирует идентичную аминокислоту.

В случае автокатализа порядок аминокислот определяется их порядком в исходной полипептидной цепи, которая действует в качестве шаблона, обладающего свойствами специфического адсорбента. Адсорбированные аминокислоты объединяются пептидной связью благодаря действию неспецифического фермента. Таким путем формируется новая идентичная пептидная цепь, которая, отъединяясь, становится молекулой специфического белка.

Что же удерживает молекулу белка в расправленном состоянии в процессе ее удвоения? Функция поддержки пептидной цепи белка в расправленном состоянии была приписана нуклеиновым кислотам.

Таким образом, и в этом случае ДНК и РНК приписывается неспецифическая функция. Вся специфичность явлений наследственности была перенесена только на белок. Образование ферментов в клетке рисовалось как появление белковой молекулы, идентичной гену и возникающей тем же механизмом автокатализа. С этой точки зрения запись генетической информации казалась очень сложной, исходя из того, что многие специфические белки, и в том числе ферменты, имеют своих гомологов в хромосомах.

Однако, как это было указано выше, имелись серьезные факты, опровергающие представление о неспецифической роли нуклеиновых кислот. В ряде случаев было доказано, что генетическая специфичность определяется специфичностью ДНК или РНК. Однако белки определяют основы жизни и развития. Возник вопрос, каким же образом специфические белки появляются в клетке. С этой точки зрения генетическая специфичность, заключенная в нуклеиновых кислотах, должна каким-то образом обусловливать направленный синтез белков в клетке. Впервые на специфическую организующую роль ДНК и РНК в процессе появления специфических белков в клетке указал Дауне. Опираясь на конкретную модель структуры ДНК, предложенную Уотсоном и Криком, выступил Гамов, который в ряде работ также развил идею, что имеющиеся в структуре ДНК специфические группы нуклеотидов создают точку организации соответствующих аминокислот. Специфичность порядка группы нуклеотидов создает специфичность полипептидной цепи.

За последние годы получено много фактов о синтезе белков в протоплазме в связи с наличием РНК и ее структурных образований. Эта теория была развита Браше, Б, В. Кедровским и другими. Однако Касперсон отстаивал воззрение, что белок, синтезируется и в ядре в прямой связи с ДНК. Однако какова связь процессов синтеза белка в цитоплазме с ядром? Независимы эти процессы или ядро контролирует специфику образования плазменных белков? До самого последнего времени не было доказательств тому, что РНК цитоплазмы связана в своем происхождении с деятельностью ядра, хотя это и казалось очень вероятным. Однако это доказательство было дано в работе Гольдштейна и Плаут. Авторы экспериментировали с амебой (Amoeba proteus), пищей которой служила Tetrahymena pyriformis. Последних разводили на среде с добавлением в нее радиоактивного фосфора (32РО4). Ядра амеб, которые содержат в основном РНК, включали радиоактивный фосфор. Такие ядра с помощью микроманипулятора пересаживали в нормальных амеб, ядро которых было удалено, и в амеб, у которых свое ядро оставалось. Радиоавтография амеб, фиксированных спустя 5 часов после пересадки, показала, что 32Р в это время содержится лишь в ядре. Спустя 12 часов и более заметные количества радиоактивного фосфора оказываются перенесенными в цитоплазму. Опыты с применением рибонуклеазы показали, что 32Р как в ядре, так и в цитоплазме входил в состав РНК. Встает вопрос: переходит ли РНК, синтезированная в ядре, в цитоплазму, или ядро снабжает цитоплазму какими-либо предшественниками? Во всяком случае ясно, что 32Р покидает ядро не в форме иона 32РО4. Это доказано тем, что в двуядерных клетках, полученных при пересадке радиоактивного ядра в амеб, имеющих свое нормальное ядро, 32Р переходил в РНК цитоплазмы, но не внедрялся в состав второго нормального ядра. Ядро амеб содержит более высокую концентрацию РНК сравнительно с цитоплазмой. Если бы РНК, выделенная радиоактивным ядром, была бы той же природы, что и цитоплазматическая РНК, то следовало бы ожидать внедрения радиоактивной РНК в нормальное второе ядро. Этого нет, следовательно, та РНК или ее предшественники, которые после синтеза в ядре выходят в цитоплазму, модифицируются по сравнению с конституционной РНК ядра. Роль ядра, состоящая в контроле над синтезом специфической цитоплазматической РНК, не исключает возможности синтеза РНК в ряде случаев и в самой цитоплазме.

Все эти факты и теоретический анализ вплотную подвели к современному этапу, который характеризуется величайшим триумфом генетической биохимии — раскрытием сущности генетического кода и генетических механизмов синтеза белков.

В свете сказанного ясно, что проблема генетического кода связана с выяснением механизма, детерминирующего первичную структуру белка, т. е. последовательности в нем аминокислот

Генетическое доказательство триплетной природы кода

под контролирующим влиянием ДНК. В проблеме кода, во-первых, необходимо установить кодирующую единицу, т. е. группу азотистых оснований ДНК, которая определяет включение одной аминокислоты в полипептидную цепь. Такая единица получила название кодона. Во-вторых, встала задача расшифровки кодонов, т. е. определение той последовательности азотистых оснований, которая свойственна включению каждой из 20 первичных аминокислот при синтезе белков.

Очевидно, что если бы кодон содержал одно азотистое основание, то четыре разных основания могли бы кодировать только четыре разные аминокислоты. При кодоне из двух оснований — 16 и только при условии, что кодон содержит три азотистых основания, появляется возможность кодировать все 20 аминокислот. Число сочетаний в этом случае (43) равно 64, т. е. даже превышает требуемое число — 20.

Генетическое доказательство триплетной природы кода было дано Криком и соавторами. Представим, что ген дикого типа состоит из повторений триплетов ЦАТ (рис. 77).

В случае вставки одного нуклеотида с места вставки начинается ряд новых триплетов — ТЦА. В случае делеций одного нуклеотида — триплетов АТЦ. В случае и вставки и делеций в разных местах гена возникает нарушение, а затем восстановление к нормальным триплетам.

Все эти типы мутаций были получены Криком на фаге Т4 с помощью обработки акридином. Из этих опытов было сделано три основных вывода.

1. Генетической единицей — кодоном являются три нуклеотида, которые считываются одновременно и детерминируют включение в белок определенной аминокислоты.

2. Код вырожден, что означает кодирование одной и той же аминокислоты несколькими разными триплетами.

3. Ген представляет собой определенный участок в ДНК, его информация считывается с начальной точки.

Выяснение общей природы генетического кода было большим шагом вперед, но оставался нерешённым не менее важный вопрос о точном строении каждого из 64 кодонов. Исторически решение этой проблемы оказалось разделенным на два этапа.

В 1961 г. два американских биохимика М. Ниренберг и Г. Маттеи доказали, что кодон, отвечающий на синтез аминокислоты фенилаланина, является тринуклеотидом типа YYY. Им удалось разработать остроумный прием для получения информации о составе кодонов. В систему для синтеза белка вводились в качестве матрицы синтетические олигонуклеотиды, состав которых был известен. В первом опыте, давшем положительный результат, в качестве такой матрицы была использована синтетическая РНК, содержавшая только один сорт оснований — урациловые (полиуридиловая РНК). В ответ на введение этой матрицы начался синтез белка, состоявшего также из одинаковых аминокислот — фенилаланиновых. Использовав этот прием, Ниренберг, а также другой американский исследователь С. Очоа в короткий срок смогли получить информацию о суммарном составе большого числа кодонов (табл. 11).

Было обнаружено, что кодоны универсальны, так как одни и те же полирибонуклеотиды кодируют включение одинаковых аминокислот как в клетках бактерии кишечной палочки, так и в клетках высших организмов.

Второй этап в изучении структуры генетического кода оказался связанным также с именем М. Ниренберга. В 1964 г. М. Ниренберг и Ф. Ледер задались целью определить минимальную длину олигонуклеотида, который может быть присоединен к рибосоме, с тем чтобы вызвать специфическое связывание с ней аминоацил —т— РНК. Им удалось показать, что такой минимальной «информационной» РНК может быть олигонуклеотид. содержащий всего три основания. Поскольку химическими методами можно синтезировать тринуклеотиды точно известного строения, Ниренберг и Ледер получили возможность следить за присоединением аминоацил — т — РНК, несущих любую из аминокислот к любым кодонам.

В короткий срок в лаборатории Ниренберга была выполнена работа по определению большинства кодонов. Параллельно с этим Гобинд Корана, Чарлз Яновский, Герман Виттман и другие смогли проверить правильность кодонов, найденных в лаборатории Ниренберга. Эта проверка заключалась в определении состава белков, синтезируемых на искусственных матрицах, в определении замен аминокислот в ряде мутантов бактерий, вирусов, животных и растений. Совпадение данных проверки с таблицей кода, предложенной Ниренбергом, явилось достаточно убедительным доказательством универсальности кода.

Основной вопрос, касавшийся проблемы функционирования генов, заключался в определении пути от гена к белку. После опубликования гипотезы Крика и Уотсона, тезис о связи синтеза белка с функционированием ДНК и РНК стал исключительно популярным, хотя первые работы, показавшие эту связь, были выполнены еще в 40-х годах Ж. Браше и Б. В. Кедровским.

Г. Гамов, одним из первых попытавшийся нащупать путь от гена к белку, постулировал, что аминокислоты могут сорбироваться непосредственно на ДНК, узнавая специфические триплеты и присоединяясь к ним. Однако такое простое решение проблемы было неверным, поскольку точного стерического соответствия между участками ДНК и молекулами белков найти не удалось. Кроме того, широкий ряд экспериментов говорил о том, что синтез белка связан прежде всего с рибонуклеиновыми кислотами.

Большим шагом вперед было установление локализации мест синтеза белков внутри клетки. Разработка методов электронного микроскопирования ультратонких срезов клеток, определения молекулярных весов с помощью ультрацентрифугирования, биохимических анализов белка, РНК и ДНК, изотопных методов позволили в начале 50-х годов приступить к интенсивному изучению биосинтетической активности живых клеток, и прежде всего синтеза белка.

Было установлено, что, наряду с крупными органеллами клеток, такими, как митохондрии и пластиды, в них обнаруживаются гораздо более мелкие по размерам структуры. Эти структуры располагаются в местах, где наблюдается синтез белка, В их составе было найдено примерно равное содержание белка и РНК, и они получили название рибосом.

Было установлено, что именно в рибосомах и осуществляется синтез белков. Кроме того, в синтезе белков несомненное участие принимали молекулы РНК.

Связь между ДНК, РНК и белком можно было легко объяснить, предположив, что РНК синтезируется на ДНК, затем соединяется с рибосомами, где и определяет, какие белки необходимо синтезировать.

Такая картина могла просто объяснить многие загадки, и 5—7 лет казалось, что именно так и обстоит дело в живых клетках. Вместе с тем, гипотеза была хороша тем, что она позволяла предпринять широкое экспериментальное изучение ее правоты.

В числе таких экспериментов важное место заняли опыты по изучению так называемого нуклеотидного состава ДНК и РНК. В лабораториях Э. Чаргаффа и А. Н. Белозерского был установлен факт фундаментальной важности. Изучение соотношения пар AT и ГЦ в ДНК разных организмов выявило серьезные отличия в качественном составе ДНК. Одни организмы характеризовались большим содержанием пар AT, чем ГЦ, другие, напротив, несли больше пар ГЦ. Более того, нуклеотидный состав оказался надежным видовым признаком.

Но предположение о том, что РНК рибосом представляет . собой продукт, синтезированный на ДНК, требовало, чтобы нуклеотидный состав РНК отражал таковой состав ДНК. Исходя из этого, А. Н. Белозерский и А. С. Спирин начали изучение нуклеотидного состава клеточной РНК и ДНК у разных организмов. Так как на долю РНК рибосом приходится основная доля клеточной РНК, то следовало ожидать получения совпадающих цифр. Однако эксперимент показал, что никакого соответствия между нуклеотидным составом суммарной клеточной РНК и ДНК на деле не существует. Этот вывод А. Н. Белозерского и А. С. Спирина был истолкован некоторыми исследователями как принципиальное опровержение схемы ДНК — РНК — белок, хотя сами авторы полагали, что, возможно, такая связь существует, но только процентное соотношение тех молекул РНК, которые синтезировались на ДНК, и каких-то других молекул РНК невелико и первые составляют небольшую долю от вторых. Это было первым указанием на существование особой информационной РНК.

Пропасть, разделявшая ДНК от клеточных РНК, оказалась заполненной в 1961 г., когда Волкин и Астрахан исследовали вновь синтезируемую РНК в бактериальных клетках, и действительно обнаружили новый класс РНК, так называемую информационную РНК. Следуя гипотезе Ф. Жакоба, что эта особая РНК должна быть короткоживущей, быстросинтезируемой и высокомолекулярной, эти авторы использовали метод так называемого импульсного мечения. В клетку на короткий отрезок времени вводились предшественники РНК, после чего вновь синтезированную РНК выделяли из клетки и анализировали. Выяснилось, что эта РНК полностью совпадает по составу с ДНК клеток. Затем информационное соответствие этой РНК, названной информационной РНК (синонимы — РНК — посредник, матричная РНК, мессенджерная РНК), было установлено в опытах по молекулярной гибридизации. Этот метод, разработанный П. Доти, Г. Шпигельманом и другими, заключается в том, что молекула ДНК денатурируется, иначе говоря, нити ДНК разделяются в растворе. Они могут при создании подходящих условий снова соединиться и закрепиться водородными связями. Такое соединение, очевидно, возможно только в том случае, когда нити взаимно комплементарны. Этот метод и назвали гибридизацией. Выяснилось, что можно соединить не только две нити ДНК друг с другом, но и нить ДНК с синтезированной на ней нитью РНК. Использование этого метода позволило доказать, что быстро синтезируемая РНК является продуктом гена. Затем было показано, что и-РНК перед началом синтеза белка соединяется с рибосомами. Рибосомная РНК, как оказалось, не участвует в синтезе белка и потому не несет специфической информации, и нет ничего удивительного в том, что Белозерский и Спирин не смогли обнаружить совпадения нуклеотидного состава суммарного препарата РНК (являющегося в значительной мере рибосомной РНК) и нуклеотидного состава ДНК.

Примерно в это же время был обнаружен третий вид РНК — так называемая транспортная РНК. Низкомолекулярная по сравнению с информационной и рибосомной РНК транспортная РНК растворима в клетке, и поэтому вначале ее называли растворимой РНК.

Открытие транспортной РНК позволило разрешить еще одну загадку, связанную с белковым синтезом, так как прямого стерического соответствия между нуклеиновыми кислотами и белками обнаружено не было, следовало узнать, каким образом аминокислоты определяют нужное место при сборке полипептидной цепи.

Гипотеза, объясняющая это затруднение, была высказана Ф. Криком (адапторная гипотеза). Согласно этой гипотезе в клетке должно было существовать по крайней мере 20 сортов особых адапторных РНК, задача которых заключалась в том, чтобы соединяться с аминокислотами (отсюда 20 сортов адапторных РНК, по одному сорту на каждую из аминокислот), и в том, чтобы уметь узнавать соответствующий данной аминокислоте кодон. Поскольку соединение РНК с аминокислотой не могло совершаться без участия ферментов, Крик постулировал существование не менее 20 специфических активирующих ферментов, катализирующих реакцию присоединения данной аминокислоты к данной адапторной РНК.

Адапторная гипотеза Крика получила блестящее подтверждение после обнаружения т-РНК. Эти РНК действительно соединялись одним концом с аминокислотой и несли в определенном месте триплет, комплементарный кодону для данной аминокислоты. Этим триплетом (или антикодоном, как принято его называть) т-РНК, соединенная с аминокислотой (амино-ацил-т-РНК), присоединялась к и-РНК. Такое присоединение осуществлялось только в рибосоме, что объяснило роль последних в синтезе белка.

Таким образом, путь от гена к белку был установлен и было найдено, что белковый синтез состоит из многих реакций и включает в себя много сортов молекул. Следует также упомянуть, что в последнее время удалось раскрыть механизмы начала синтеза и обрыва синтеза белка в бактериальных клетках. Начало синтеза осуществляется с помощью специального класса т-РНК — формилметиониновой т-РНК. По-видимому, только эта т-РНК может узнать начальную точку чтения в и-РНК и все белки должны были бы начинаться с этой аминокислоты. Однако этого на деле не оказалось. Последующие работы позволили доказать, что после окончания синтеза белка с помощью специальных ферментов от него отщеплялась либо формильная группа, либо целиком формилированный метионин.

Обрыв чтения происходит на одном из трех особых триплетов, так называемых бессмысленных кодонах (УГА, УАГ и УАА), которые не соответствуют никакой аминокислоте и потому обрывают синтез белка. Кстати, обнаружение этих кодонов позволило понять, почему после некоторых мутаций (вызывающих возникновение именно этих кодонов УГА, УАГ и УАА) получаются короткие отрезки полипептидных цепей.

Наконец, упомянем о том, что благодаря работе групп Холли, А. А. Баева и других удалось установить точное строение нескольких т-РНК. В настоящее время известна структура шести т-РНК.

Современный этап в учении о молекулярной структуре гена оказался связанным с изучением фагов, вирусов и бактерий.

Успех этих работ (в первую очередь с фагом Т4), выполненных С. Бензером, а также работ с мутациями салмонеллы, выполненных М. Демерецем и другими исследователями, обеспечен генетическим анализом, проведенным на гигантском количестве особей.

Мы видели выше, что анализ тонкого строения гена начат на дрозофиле, для которой обычный эксперимент охватывает 102—104 особей. Опыт на бактериях вовлекает 108—1011 клеток, а на бактериофагах еще большее число частиц фага. Вполне понятно, что разрешающая способность фагов и бактерий как в деле получения новых мутаций определенного гена, так и для рекомбинаций

Картина сложного гена в районе гистидина у салмонеллы

внутри гена исключительно велика, причем бинационный анализ дополняется использованием делеций и вставок.

В результате генетический анализ позволяет обнаружить столь малые части генетического материала, что они приближаются к элементарным химическим составным частям молекул ДНК в виде нуклеотидов. Если к этому добавить, что под действием аналогов оснований определенным образом изменяются нуклеотиды в молекулах ДНК и и-РНК, то становится ясным, как далеко продвинулось исследование тонкой структуры гена. При этом осуществляются генетико-биохимические исследования функциональных взаимоотношений отдельных частей внутри гена.

На рисунке 78 представлена картина сложного гена у салмонеллы в районе синтеза гистидина. Мутации, делеций, трансдукции и кроссинговер могут захватывать как отдельные элементарные единицы внутри локусов, так и группы единиц. Функциональная связь между частями сложного гена показывает картину интеграции, обеспечивающей последовательное превращение веществ, при синтезе гистидина.

На рисунке 79 представлена молекулярно-генетическая карта района rII в нити бактериофага Т4. Генетическая картина тонкого строения гена получена путем изучения мутаций, рекомбинаций и делеций. Использование аналогов оснований позволило раскрыть химическую природу отдельных элементарных мутационных участков в виде определенных пар азотистых оснований. Мы видим два сложных гена — цистрон А и цистрон В. Рекомбинации внутри гена позволяют выделить наименьшую единицу рекомбинации — рекон в виде пары нуклеотидов. Элементарной единицей мутации — мутоном служит химическое изменение отдельных нуклеотидов. Сложный ген состоит из цепи линейно расположенных элементарных участков в виде кодонов.

Обращаясь к результатам современного молекулярно-генетического анализа структуры гена, можно указать на пять основных положений.

1. Ген не является единицей мутаций, напротив, он состоит из отдельностей, расположенных в нем в линейном порядке; эта линейность отражает полимерную структуру молекул ДНК. Элементарные мутации основываются на химической замене, потере или вставке отдельных нуклеотидов в цепи ДНК.

2. Ген не является единицей рекомбинаций, ибо у фагов и у бактерий показано, что рекомбинации идут внутри гена, проходя между элементарными мутационными участками (отдельными нуклеотидами).

3. Ген не является единицей функции, напротив, для его действия характерна интеграция эффектов его отдельных частей; такое сложное функциональное объединение получило название цистрона.

4. Тонкое строение гена отражает биологическую функцию участка молекулы ДНК. Это показано при расшифровке химической (нуклеотидной) природы цистронов А и В в районе rII бактериофага Т4. Проблема генетического кода неразрывно связана с молекулярно-генетической расшифровкой нуклеотидного строения гена.

5. Передача генетической информации в клетку осуществляется путем воспроизведения и молекулярного переноса генетической информации, записанной в ДНК. Главным в этом потоке воспроизведения информации является генетически детерминированный синтез белков. Матрицей, от которой начинается воспроизведение информации, является тонкая структура гена (взаимоположение нуклеотидов в кодовых триплетах и последовательность триплетов внутри гена). Молекулы информационной РНК синтезируются, отражая структуру гена, чем обеспечивается транскрипция информации гена. Явление трансляции, т. е. активизация информации при синтезе белков, происходит после перехода молекул и-РНК в рибосомы.

В свете изложенных положений современной теории гена обратимся к результатам, полученным в свое время при разработке центровой теории.

Молекулярная карта генетического района r II у фага T4 с локализацией на ней пар оснований, установленной в опытах по обратному мутированию микролокусов под действием 2-аминопурина, бромурацила и гидроксиламина

Основные принципиальные результаты, достигнутые при анализе аллелей achaete и scute, у дрозофилы сводятся к трем следующим положениям:

1. Ген не является единицей мутации, напротив, он состоит из отдельностей, расположенных внутри него в линейном порядке. Каждая из отдельностей представляет собой элементарный мутационный участок, т. е. наименьшую часть гена, способную претерпевать самостоятельные мутационные изменения. Эти отдельные участки были названы центрами. Мутации могут захватывать как отдельные центры, так и ту или иную их группу. Различия в мутационных сочетаниях центров послужили созданию плана внутреннего строения базигена achaete scute, представленного на рисунке 76.

2. Ген не является единицей рекомбинаций, ибо кроссинговер может проходить внутри гена. Исходя из этого были осуществлены поиски кроссинговера базигена achaete scute, которые увенчались успехом.

3. Ген не является единицей функций, напротив, его действие в целом обусловлено интеграцией функций его отдельных частей (центров).

Таким образом, в принципиальном отношении вопрос о дроблении гена на элементарные единицы, возможность кроссинговера внутри гена и функциональной интеграции частей гена были решены в исследованиях по ступенчатому аллелизму. Использованные в этих работах методы комплиментации, делеций, мутаций и рекомбинаций и сейчас играют ведущую роль в генетическом анализе тонкой структуры гена у фагов и бактерий.

Новым в современном анализе является связь генетического уровня с молекулярным, биохимическое истолкование внутригенной интеграции, разработка проблемы кода и молекулярной записи генетической информации, воспроизведение генетической информации в клетке и использование химического мутагенеза для определения нуклеотидной природы гена.

Вполне понятно, что в 1929—1933 гг. разработка этих вопросов была невозможна. Однако в общей форме необходимость анализа молекулярных структур, лежащих в основе строения гена, была ясна и тогда. Н. П. Дубинин, сравнивая особенности изменений отдельных центров и базигена в целом, писал: «Все это приводит нас к представлению о глубоком отличии мутационной изменчивости всего базигена achaete scute и составляющих его центров. Изменения первого сложны и многообразны. Изменения центров однозначны и гораздо более просты. Ген представляет собой сложную физико-химическую структуру, которая может многообразно изменяться. Центр, по-видимому, значительно более простая структура, включенная в ген. Это различие в поведении центра и гена в мутационной изменчивости, может быть, в конечном итоге позволит пролить свет на взаимоотношения их как физико-химических структур... Обнаружение истинных форм изменчивости всех центров базигена achaete scute должно в конечном итоге вскрыть глубочайшую картину модели строения и изменения того физического субстрата, который слагает особый ген achaete scute».

В наши дни для района rII у фага Т4 реализована эта задача, которая более 30 лет назад была поставлена при анализе ступенчатого аллелизма у дрозофилы.

Обратимся к более детальному разбору современных достижений в области молекулярного анализа в строении гена.

Ген представлен в клетке молекулярными структурами ДНК; поэтому вполне естественно, что мутации генов связаны с изменением в химическом строении нуклеиновой кислоты. Эти изменения вызываются путем замены оснований, утраты оснований, удвоений внутригенных участков, захватывающих одно или несколько оснований, и, наконец, путем появления новых порядков оснований при инверсиях или других перестановках внутри генетического материала, когда разрывы генетической нити проходят внутри генов. У фагов последний тип мутаций ограничивается пределами одной генетической нити, с которой связана одна группа сцепления. У высших форм разрывы генетической нити, ведущие к перестановкам генетического материала, выходят за пределы одной хромосомы, обусловливая широкую изменчивость путем появления хромосомных перестроек. .Однако если при появлении хромосомных перестроек разрывы идут внутри генов, то они должны являться причинами нарушений в химической структуре генов. Кроме того, даже только за счет нарушения во взаимоположении целых генов или их частей, связанных функционально, функции генов могут быть изменены. Это служит причиной явлений эффекта положения генов, показывающих, что функции гена зависят от физиологической организации хромосомы.

Причиной описанных выше внутригенных изменений, т. е. преобразований в локальной химической структуре ДНК, во многих случаях, по-видимому, является неправильная авторепродукция малых участков генетического материала. Этот процесс, ведущий к появлению внутригенных рекомбинаций, получил название трансмутации.

Наименее изученное свойство генов — их способность к гомологичному притяжению, возникающему на определенных этапах жизни клетки, и в первую очередь в процессе мейоза, когда происходит конъюгация гомологичных хромосом. Экспериментальное изменение структуры хромосом показывает, что любая малая, микроскопически обнаружимая часть хромосомы в таких условиях обладает способностью «найти» своего гомолога и конъюгировать с ним. Свойство гомологичной конъюгации обеспечивает такой важнейший процесс, как конъюгация хромосом в мейозе, а свойство комплементарной конъюгации, как мы видели выше, лежит в основе авторепродукции ДНК и гетерокатализа РНК на матрицах генов.

Дифференциальная конъюгация гомологов в хромосоме может быть продемонстрирована на ряде примеров. Четкие картины дает петлеобразная конъюгация гомологичных генов в гетерозиготах по инверсии. Инверсии являются структурными изменениями хромосом, при которых один из средних участков хромосомы оказывается перевернутым (инвертированным), занимая в ней обратное положение. Так, если в нормальной хромосоме мы имеем порядок локусов в виде 1—2—3—4—5—6—7—8—9—10, то при инверсии участка 2—3—4—5—6—7—8 возникает хромосома с инверсией, обладающая новым порядком локусов в виде 1—8—7—6—5—4—3—2—9—10. У гетерозигот, имеющих в данной паре одну нормальную хромосому и одну хромосому с инверсией, казалось бы, конъюгация хромосом должна быть резко нарушенной, если инвертированный участок достаточно велик. Однако этого нет, так как гомологи и в этой измененной структуре «находят» друг друга, и возникает характерная петлеобразная конъюгация на пары хромосом, одна из которых нормальная, а другая содержит инверсию. Если при такой конъюгации внутри инверсии происходит кроссинговер, возникает характерное нарушение хромосомных структур. С одной стороны, возникает ацентрический (без центромеры) фрагмент, отстающий от расходящихся хромосом и резорбирующий в цитоплазме. С другой стороны, образуется дицентрическая (с двумя центромерами) хромосома, которая растягивается между двумя полюсами деления и образует так называемый хромосомный мост, разрываемый при образовании двух дочерних клеток. У гетерозигот по транслокации имеется картина крестообразной конъюгации гомологов.

Нет сомнений, что природа сил гомологического притяжения генов, в других фазах жизни клетки сменяющегося на силы отталкивания, имеет в своей основе вполне реальные физические и химические явления. Установление их природы представляет собой одну из существенных задач молекулярной биологии.

Однако главным в проблеме гена является вопрос о его химической структуре и его функциях. Проблема структуры гена обсуждена выше. Вопрос о первичных функциях гена связан с качественной расшифровкой кода генетической информации и анализом форм «считывания» кода, т. е. с раскрытием тех закономерностей, которые определяют синтез первичных продуктов гена в виде молекул информационной РНК. Анализ форм считывания кода может вестись и по первичной структуре синтезируемых белков, ибо молекулы и-РНК как матрицы имеют прямое отражение в первичной структуре белков.

Выше мы разобрали основные принципы, управляющие кодированием генетической информации в молекулах ДНК. Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты построена из сотен тысяч или даже миллионов нуклеотидов. В ней в разных взаимосочетаниях повторяются четыре нуклеотида, различающихся по азотистым основаниям, а именно по наличию аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) или цитозина (Ц). В молекуле рибонуклеиновой кислоты насчитываются тысячи нуклеотидов; она содержит те же три азотистых основания, что и молекула ДНК, а именно А, Г, Ц и, кроме того, урацил (У), наличие которого, так же как и отсутствие тимина, отличает состав ее от ДНК.

Главный вопрос, касающийся функционирования генов, состоит в том, как последовательность нуклеотидов в нуклеиновых кислотах определяет последовательность аминокислот в соответствующих белках. Другими словами, это означает, каким образом программа для последовательности аминокислот в белках «записана», или закодирована, в последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах.

Электронная фотография фага T2

В настоящее время основные причины кодирования и считывания информации, связанные со структурой гена, и перспективы расшифровки генетического кода в аспекте проблемы функционирования гена в значительной мере ясны.

Обратимся сначала к основам генетического кодирования и к формам считывания информации. Однако, поскольку вопросы эти решены на примере анализа структуры и функционирования генов у бактериофага Т4, необходимо более подробно разобрать методы анализа структуры гена у Т4. Без этих знаний будут неясны те пути, используя которые современные генетические методы позволили вскрыть фундаментальные биохимические явления, характеризующие функции генов.

Исследования по генетике бактериофага обладают громадными преимуществами. После заражения клеток бактерий уже через 20 мин можно получить миллиарды частиц фага. В результате использования генетических методов при тех исключительных возможностях, которые представляются опытами с массами частиц фага, исследователи проникают в такие глубины строения наследственных молекул, перед которыми пока бессильны все современные химические, физические, и в частности электронномикроскопические, методы.

Схема внедрения и размножения частицы фага в клетке бактерии

На рисунке 80 показаны фотографии фага Т2, полученные под электронным микроскопом, при увеличении в 500000 раз. Мы уже видели ранее, что в головке фага под ее белковой оболочкой скрывается ДНК, с которой связана генетическая специфика фага. Именно молекулы ДНК внедряются в клетку бактерии и перестраивают всю биохимическую машину клеточного метаболизма. В такой клетке идет синтез молекул ДНК и белков, специфичных для фага, а одна внедрившаяся частица авторепродуцируется до 100 новых частиц фага (рис. 8). Если мы выделим отдельную нить двойной спирали молекулы ДНК и получим фотографию такой молекулы под электронным микроскопом, то обнаружим картину, изображенную на рисунке 82. Длина отрезка молекулы ДНК, изображенного на рисунке, соответствует размеру двух генов (цистроны А и В) у фага Т4. Что может дать такая картина для понимания внутренней структуры и функции гена? Очень мало. Однако генетические методы вскрыли эту внутримолекулярную организацию наследственных молекул и установили главные принципы в первичных эффектах генов. Фундамент для этих открытий был заложен путем разработки генетической карты генов в районе rII бактериофага

Электронномикроскопическая фотография отрезка молекулы ДНК

Т4. Мы уже видели, что при заражении клетки бактерии отдельной частицей в ней через 20 мин возникает 100 частиц фага. Они заражают соседние клетки, и на сплошной поверхности агар-агара в чашке Петри возникает так называемое стерильное пятно. Это пятно появляется на месте группы разрушенных клеток, в нем содержатся миллионы или миллиарды частиц фага. Нормальные частицы фага дают обычно стандартные стерильные пятна (рис. 83). Однако если первоначальная частица фага претерпевает мутацию, то и все ее потомки в данном стерильном пятне будут обладать этой мутацией. Сама форма пятна оказывается измененной, что видно на рисунке, где стерильное пятно размытой формы (взято в квадрат на рисунке) содержит мутационные формы фага Т4. При использовании двух разных штаммов кишечной палочки — штамма В и штамма А — было показано, что стерильные пятна стандартного типа развиваются в клетках из популяций обоих штаммов. Однако мутантные стерильные пятна появляются только в клетках штамма В (рис. 84). Неспособность мутантов образовывать стерильные пятна на устойчивых против них клетках штамма К сыграло важную роль в работе по созданию генетической карты района rII у фага Т4. Вместе с тем само создание такой карты оказалось связанным с тем, что мутанты rII могут расти на клетках штамма К в том случае, если они проникают в эти клетки одновременно с частицами нормального, немутантного фага. Тот факт, что мутанты растут на клетках штамма К, пораженных нормальным фагом, показывает, что нормальные частицы фага вносят какие-то элементы, поражающие клетки штамма К, после чего на них начинает размножаться и мутантная форма фага, не обладающая этими элементами, преодолевающими устойчивость клеток штамма К. Именно функциональная структура, утерянная в мутантах rII, и послужила объектом детальнейшего генетического анализа. Она оказалась связанной с небольшим участком в молекулярной структуре ДНК фага, для которого удалось

Картина нормальных стерильных пятен, образуемых бактериофагом

Заражение бактериофагом клеток штаммов В и К кишечной палочки при посеве смесью мутантных и нормальных форм

в конце концов раскрыть не только его структуру, но и принципы кодирования генетической информации.

Материалом для создания карты района rII послужило исследование тысяч мутантов, изменявших форму стерильных пятен, найденных при поражении клеток кишечной палочки штамма В. Процесс появления мутаций показан на рисунке 85. Мы видим на этом рисунке, как одна частица фага из одного стерильного пятна (рис. 85, 1). проникает в клетку бактерии штамма В (рис. 85, 2). Эта частица внедряет двойную молекулярную нить ДНК в тело бактерии, где начинается авторепродукция этих молекулярных структур (рис. 85, 3). Среди новых молекул ДНК одна претерпевает мутацию (обозначена черным в одном из участков нити на рис. 85, 4). После образования частиц фага бактерия лизируется (рис. 85, 5) и фаг заражает новые клетки бактерий. Среди новых стерильных пятен одно имеет особую форму, оно возникло из группы клеток (рис. 85, 5), среди которых одна первичная была поражена мутантной частицей фага (рис. 85, 6).

Опыты по рекомбинации мутантов осуществляются при помощи заражения клеток бактерий сразу несколькими разными частицами фага (рис. 85, 1). В случае нанесения на клетки бактерий большого количества частиц фага в клетку одновременно проникают две, три или большее количество фаговых частиц.

При использовании смеси двух разных мутантов фага Т4 в клетку попадают оба типа мутантных частиц. Картина такого проникновения двух разных мутантов фага Т4 показана на рисунке 85, 2. При авторепродукции в такой клетке большинство частиц принадлежит одному или другому исходному мутантному типу (рис. 85, 3). Однако небольшое количество частиц оказывается новым. Эти частицы возникают путем рекомбинаций между исходными мутантами, они обладают или обоими мутантными изменениями, или оказываются нормальными, свободными от мутаций. Эти рекомбинантные формы показаны на рисунке 85, 4. Мы видим, что наряду с мутантными локусами, отмеченными черными участками в разных частицах, здесь же возникают частицы с двумя черными участками (двойные мутанты) и частицы, свободные от черных участков (нормальные частицы). При заражении новых бактериальных клеток смесью частиц из лизирующей клетки (рис. 85, 5), которая в основном состоит из исходных мутантных форм, мы видим (рис. 85, 6), как на клетках штамма В развивается множество стерильных пятен. Если же посеять эту смесь фаговых частиц на клетках штамма К, картина резко изменится. Все мутантные формы погибнут, и разовьются только редкие рекомбинантные нормальные частицы фага (рис. 85,6). При этом, как бы ни были редки эти рекомбинанты, они могут быть уловлены путем посева частиц на провокационном фоне в виде клеток штамма К. Сотни миллионов потомков могут быть исследованы на появление рекомбинантов. В этом случае мы встречаемся с исключительными преимуществами, которыми обладает частица фага по сравнению с высшими формами. Частота рекомбинаций определяется расстоянием между рекомбинируемыми участками вдоль по хромосомной нити. У фага мы можем изучить рекомбинацию между участками, расположенными один от другого на расстояниях, лежащих внутри отдельных молекул ДНК, так как в опыте участвуют сотни миллионов и миллиардов нитей ДНК, между которыми идет обмен участками. Осуществить такой опыт для изучения хромосом у высших форм совершенно невозможно. Для бактериофага метод анализа рекомбинаций может исчерпать все возможные обмены для небольшого участка в молекулярной структуре ДНК. Оказалось, что разрешающая способность анализа обменов участками нити ДНК у фага такова, что можно получить рекомбинации между мутантами, отстоящими один от другого на расстояние одного нуклеотида в молекуле ДНК.

Однако даже в опытах с бактериофагом «скрещивание» тысяч мутантов и изучение рекомбинаций между ними являются

Процесс мутирования и рекомбинации у бактериофага

непосильной задачей. В такой работе потребовалось бы проведение миллионов совместных заражений. Эта задача гораздо более экономно была разрешена при использовании метода делеции. Еще в работах с дрозофилой, кукурузой и другими организмами было показано, что отдельные участки хромосом могут теряться, вследствие чего в хромосоме возникает нехватка (делеция). Делеции могут быть разных размеров — от хорошо различимых под микроскопом до субмикрсскопических потерь генетического материала. На рисунке 86 изображен метод локализации гена в хромосоме Дрозофилы методом делеций. В нити ДНК бактериофага мы не можем с помощью электронного микроскопа обнаружить делеции части молекулярных структур ДНК. Однако факт появления делеции может быть установлен генетическими методами. Известно, что генные мутации, представляющие собой изменения химической структуры определенного локуса хромосомы, могут претерпевать дальнейшие мутационные преобразования. Среди этих новых мутаций для наших целей особый интерес имеет появление обратных мутаций, т. е. возникновение нормального аллеля из мутационного. Делеции лишены этого свойства, ибо они представляют собой физические потери участков генетического материала. Этот метод различения между делециями и мутациями по способности последних давать обратные мутации и был применен при поисках делеций у бактериофага. Опыты показали, что мутации фагов, изменяющие форму стерильных пятен, действительно распадались на две четко разграниченные группы. В одной группе оказались делеции, лишенные способности претерпевать обратные мутации к нормальному аллелю, в другой — генные мутации, которые преобразуются в нормальные аллели путем обратных мутаций как в естественных условиях, так и под влиянием радиационных и химических мутагенных факторов. Изучение нескольких сот мутаций типа делеций, лишенных способности давать обратные мутации, в опытах по рекомбинациям показало, что они обладают разной величиной и расположены в линейном порядке внутри цепи молекул ДНК. Взаиморасположение генных мутаций в этом же участке нити ДНК фага изучалось опытным путем по рекомбинациям между данной генной и определенной делецией. На рисунке 87, а показаны четыре разные делеции в районе rII: делеция А — выпадение всего испытываемого района; делеции Б, В, Г— выпадение разных участков этого района.

При исследовании новой мутации с неизвестным местоположением ставился опыт по рекомбинации такой мутации X с делециями. В опыте с делецией А мутация не дает рекомбинаций (рис. 87, б). Это показывает, что мутация X возникла на rII участке, захваченном делецией. То же происходит в опыте с делецией Б. Однако с делецией В и в еще большей степени с делецией

Метод цитологической локализации гена в хромосоме дрозофилы

Г мутация X дает рекомбинации (рис. 87), ведущие к появлению нормальных частиц фага и частиц, которые одновременно обладали и мутацией и делецией. Сопоставление генных мутаций с делециями по мере увеличения количества испытываемых мутаций и делеций постепенно позволило выделять на карте все более мелкие участки. В конце концов участок нити ДНК фага удалось разделить на 80 участков, по которым различались исследованные делеций (рис. 87). Вполне понятно, что эти участки не отражают какой-то глубокой генетической дифференцировки нити ДНК фага. Они разбивают район rII по случайным принципам мутационных делеций. Поэтому участки имеют случайные размеры. Однако этот способ выделения малых участков внутри района rII и дифференцирование 80 участков имеют важнейшее значение, ибо дальнейшая работа по их внутреннему разделению привела к успеху в понимании генетических и молекулярных структур. Эта дифференцировка внутри каждого участка осуществляется путем изучения рекомбинаций между генными мутациями, возникающими внутри участка.

Встает вопрос: что же в целом представляет собой участок нити ДНК бактериофага, обозначенный как rII? Мы видели, что как делеция всего района, так делеций очень малых размеров и, наконец, отдельные внутригенные мутации приводят к поражению одной и той же функции, а именно — к изменению формы и размеров стерильных пятен и неспособности поражать клетки штамма К. Здесь возможны два решения вопроса. Или перед нами единая генетическая система, в которой поражение любой ее части ведет к потере функции, или же сложная комплексная генетическая система, каждая часть которой программирует отдельные элементы, складывающиеся уже вне нити ДНК в единую функциональную цитоплазматическую реакцию. Этот вопрос можно разрешить путем цис-транс-сравнепш мутантов. Методика

Метод делеций при локализации мутаций в районе R II у бактериофага Т4

Метод создания карты отдельных участков цистрона в районе r II у бактериофага, позволяющий сблизить генетическую карту с молекулярным уровнем в организации наследственности

цис- и транс-сравнения была разработана в опытах с дрозофилой. В случае расположения изучаемые мутантные элементы из единой системы находятся в одной хромосоме, а другая хромосома остается нормальной (рис.88). При транс-положении две мутации локализованы в разных хромосомах (рис. 88). Так было проанализировано явление псевдоаллелизма, когда элементы, разъединяемые кроссинговером, все же принадлежали к системе единого локуса. Это ясно следовало из того факта, что мутации а и б, будучи полностью рецессивными в цис-структурах, проявляли, однако, мутантные признаки в транс-структуре. Но как же использовать методику цис- и транс-анализа в генетике бактериофага, который представляет собой гаплоидную форму, обладающую ДНК? Диплоидность в этом случае оказалось возможным имитировать путем заражения клетки бактерий двумя разными формами фагов. Мы видели выше, что мутанты rII не заражают клетки штамма К. Однако при одновременном вхождении мутантных и нормальных частиц мутанты также могут расти и размножаться в клетках штамма К. В этом случае мы имеем типичную картину расположения, поскольку в клетке бактерии имеются нормальные части фага и мутационные частицы, обладающие мутациями разных частей района rII. Встает вопрос: обеспечивают ли различные участки района rII, расположенные по разным частицам фага, функции нормальной частицы? Вполне понятно, что если они принадлежат к единой генетической системе, то такого обеспечения не происходит. Предположим, что мы исследуем мутации Л и Н. При заражении клетки штамма К частицами, обладающими обеими мутациями (ЛН), и нормальными частицами мы имеем картину цис-структуры. Как мы уже знаем, в этом случае все частицы фагов репродуцируются в клетке бактерии. Однако что же происходит в транс-структурах, когда клетки заражаются фагами, одни из которых несут мутацию Л, а другие — мутацию Н? Ясно, что если эти мутации принадлежат к разным генетическим системам, то частицы фага, каждая из которых не может размножаться в клетках штамма К, теперь приобретают эту способность, поскольку разные частицы генетически взаимодополняют друг друга. Однако если мутации Л и Н касаются одной и той же генетической системы, то в транс-типе проявляется картина псевдоаллелизма и смесь из этих мутантов не в состоянии размножаться на клетках штамма К. В этом случае в транс-гетерозиготе поражается нормальная функция генетической системы инфекционного фага. Этот анализ показал, что все изученные мутанты из района rII распадаются на две группы. Мутанты, внутри которых все трансструктуры эффективны, принадлежат к единой функциональной системе, а другие — ко второй, рядом расположенной функциональной единице. Так было открыто существование двух цистронов в районе rII, один из них получил название цистрона А, другой — цистрона В.

На рисунке 89 изображен путь генетического анализа района rII. Вверху представлена карта отрезка нити ДНК с рядом локусов, среди которых имеется и район (локус) rII (рис. 89, а).

Подбором ряда делеций этот район разбивается на цистроны А и В, причем цистрон А разбивается на шесть участков, каждый из которых равен по величине цистрону В (см. рис. 89, б). В качестве примера для дальнейшего анализа обратимся к участку А5. Этот участок путем сравнения трех делеций разбивается на четыре новых более малых участка: А5а, А5b, А5с, A5d (рис. 89, в). Избираем участок А5с и путем сравнения трех еще более малых делеций разбиваем его на четыре микрорайона: A5cl; A5c2al; А5с2а2; А5с2b (рис. 89, г). Размеры микрорайона А5с2а2 уже таковы, что дальнейшее его дробление оказывается невозможным. Карта этого микрорайона создается с помощью рекомбинаций между внутригенными изменениями (рис. 89, д). В этом случае мы имеем дело уже с химическими изменениями отдельных нуклеотидов. На рисунке 89 изображен отрезок молекулы ДНК, содержащий около 40 нуклеотидов и примерно отвечающий по размерам микрорайону А5с2а2.

Таким образом, в результате генетического анализа в районе rII в нити ДНК бактериофага обнаружено существование целой серии генетических единиц. Наименьшей из них является  единица рекомбинации рекон, которая, как было показано выше, по-видимому, равна одной паре нуклеотидов. Мутации связаны с химическим изменением отдельных или нескольких нуклеотидов, с делециями или со вставками разных размеров.

Метод создания карты отдельных участков цистрона в районе r II у бактериофага, позволяющий сблизить генетическую карту с молекулярным уровнем в организации наследственности

Мутация полинуклеотида цепи ДНК под действием акридинов

Единица мутаций получила название мутона. Целые комплексы генетических единиц связаны в единую функциональную единицу в виде цистрона. Таких цистронов на участке rII оказалось два: А и В. Мутационная, а следовательно, и химическая индивидуальность микрорайонов в нити ДНК ярко проявляется при изменениях в отдельных мутонах, возникающих в естественном мутационном процессе в районе rII. Таких независимых мутационных областей в обоих цистронах обнаружено более трехсот. Мы видим, насколько индивидуализирована способность к мутациям у разных микрорайонов по длине нити ДНК в пределах цистронов А и В. Обращает на себя внимание громадная частота мутаций в одном из микрорайонов цистрона В и цистрона А.

Дальнейшее развитие исследований по генетической структуре в области цистронов А и В у бактериофага Т4 привело к экспериментальному раскрытию основных принципов генетического кодирования. Мы видим, что генетическая информация, записанная в последовательности нуклеотидов, слагающих цистроны А и В, не затрагивает основных жизненных функций фаговых частиц. Мутации приводят лишь к тому, что мутантные частицы фага теряют способность заражать устойчивый штамм кишечной палочки, а именно штамм К, сохраняя способность размножаться в клетках штамма В. Именно это обстоятельство и позволило экспериментировать с тысячами вполне жизнеспособных мутантов такого рода и раскрыть с такой полнотой генетическую структуру цистронов А и В.

Для раскрытия принципов кодирования в районе rII бактериофага решающее значение имело получение специфических мутаций в пределах цистронов А и В. Показано, что действие акридиновых производных имеет совершенно специфический характер. Под их влиянием не происходит химических изменений азотистых оснований, как это, например, бывает под действием азотистой кислоты. Акридины вызывают в нити ДНК или добавление одного из оснований (вставка), или потерю одного из бывших в молекуле оснований (делеция). На рисунке 90 изображена схема мутаций, возникающих под действием акридинов, на примере удвоения и потери гуанинового основания.

Мутантные линии фага, обладающие вставкой одного из нуклеотидов, изучались по их способности мутировать в обратном направлении, т. е. к исходному дикому типу, который может заражать клетки кишечной палочки как штамма В, так и штамма К. Оказалось, что такие мутации имеют место. Часть из них связана с потерей ранее полученного основания (вставка). В этом случае нить ДНК бактериофага приобретает исходную нормальную структуру. Другая категория мутаций исключительно интересна для анализа принципов кодирования генетической информации. Эта категория мутаций относится к классу так называемых супрессоров, т. е. мутантных генов, которые, возникая независимо от данной мутации, подавляют ее проявление.

Супрессоры, подавляющие фенотипическое проявление мутаций в области rII, отличались четырьмя весьма интересными особенностями. Во-первых, они возникали в том же цистроне, к которому принадлежала подавляемая ими мутация. Во-вторых, супрессор на генетической карте был локализован сравнительно недалеко от подавляемой им мутации. Так, для цистрона В удаленность супрессора от подавляемой им мутации не превышала 1/4 длины всего цистрона. В третьих, супрессор в генетическом отношении оказался мутацией, противоположной по своему характеру природе подавляемой им мутации. Так, если мутация, вызвавшая у бактериофага потерю способности расти на клетках линии К, представляет собой вставку одного нуклеотида, то супрессор, возвращающий ей способность к такому росту, является нехваткой одного нуклеотида. В-четвертых, супрессор, возникающий в цистроне в некотором отдалении от подавляемой им мутации, может быть выделен путем рекомбинации. В этом случае он превращается в обычную мутацию.

Таким образом, наличие в нити ДНК двух мутаций, одна из которых является обычной мутацией, а другая супрессором, взаимопогашает фенотипическое проявление обеих мутаций и приводит к появлению дикого типа. Надо сказать, что восстановление дикого фенотипа происходит не в полной мере, какое-то небольшое влияние на характер белков оказывают двойные мутанты. Однако это влияние очень невелико. Во всяком случае способность роста на клетках штамма К полностью восстанавливается у таких двойных мутантов.

Для объяснения этих результатов Крик предложил гипотезу, согласно которой генетический код считывается со стартового пункта в определенном направлении. Так, например, если мы имеем нить ДНК в виде ряда оснований (рис. 91), то специфика программирования молекул и-РНК связана с тем, что она начинается с крайнего левого триплета (стартовый пункт) и затем определяется последующими триплетами слева направо. Схема такого кодирования в нормальной нити бактериофага Т4 в районе rII изображена на рисунке 91. Мы видим, что появление вставки нуклеотида ведет к тому, что все триплеты после места вставки оказываются нарушенными. Синтез специфического

Мутации в ДНК бактериофага в результате появления одной или двух вставок отдельных нуклеотидов и обратная мутация при появлении трёх вставок

белка нарушается, и возникает мутант, не способный жить на клетках кишечной палочки штамма К. То же происходит и при потере одного нуклеотида. При сочетании обеих мутаций внутри нити ДНК нормальное кодирование нарушается только между локусами мутаций, и в результате возникает обратная мутация. Однако эти фактические данные не дают свидетельств о триплетном характере кода, ибо схемы, подобные изображенной на рисунке 91, могут быть удовлетворительно построены и при ином числе букв в слове кода. Доказательства триплетности кода были получены в опытах, где было обнаружено, что при однозначности мутаций, т. е. когда мутации в нити ДНК представлены только вставками или только делециями, имеется другая, также очень четкая закономерность. Она состоит в том, что как одиночная, так и двойная мутация нарушает программирование нормального белка. Такие мутанты не способны жить в клетках кишечной палочки штамма К. Однако появление третьей однозначной мутации восстанавливает способность нити ДНК фага в районе rII к синтезу нормального белка.

Весьма существенным для характеристики района rII в нити ДНК бактериофага Т4 было то, что повреждение синтеза белков при вставках или делециях, т. е. появление нарушенных триплетов кода, не распространяется на соседние цистроны. Мутации в цистроне А не изменяют функций цистрона В. Это показывает, что в нити ДНК в rII имеется некоторый участок, разделяющий оба цистрона. Появление нарушенных триплетов распространяется от места вставки или делеции на всю длину цистрона. Однако оно не переходит за пределы разделительного участка, и соседний участок остается неизменным.

Описанные нами принципы кодирования, установленные путем генетических экспериментов, получили новое развитие в биохимическом изучении проблемы кодирования. При использовании новых методов анализа биосинтезов (например, введение в биологическую систему искусственно синтезированных нуклеиновых полимеров) оказалось возможным установить конкретную химическую природу триплетов нуклеотидов (слов кода) для всех 20 аминокислот.

Выше мы показали, что синтез молекул белка из аминокислот происходит на рибосомах. Аминокислоты активируются рН-5-ферментами и, образуя комплекс с растворимой РНК, транспортируются к рибосомам. Специфичность синтеза белков определяется последовательностью оснований в информационной РНК, возникающей в качестве комплементарной копии соответствующих участков нити ДНК, входящих в состав гена, ответственного за программирование в клетке данного белка.

Еще до работ с синтетическими нуклеиновыми полимерами была показана возможность направлять синтез белков добавлением соответствующей информационной РНК. Процесс синтеза белков идет в пробирке в бесклеточной системе, содержащей рибосомы, ферменты и необходимые запасные вещества. При этом направление синтеза зависит от качества добавленной и-РНК. Например, если таковая система содержала рибосомы, выделенные из клеток кролика, а и-РНК — из клеток овцы, то она синтезировала белки овцы, и наоборот.

Затем был установлен факт величайшего значения, а именно, что роль и-РНК в такой бесклеточной системе могут играть синтетические полинуклеотиды с заданным содержанием азотистых оснований. Были заложены основы для биохимической расшифровки механизма синтеза белков.

Громадный интерес и еще большие трудности представляет задача расшифровки в свете полученных данных реальных генетических кодов у разных организмов. Решение этой проблемы требует знания расположения оснований внутри генов, принципов кодирования и химического характера кодовых групп разных генных систем.

В качестве подхода к решению этой грандиозной задачи очень большой интерес имеет работа по выяснению кодирующих групп, записанных в генетической нити РНК вируса табачной мозаики. В настоящее время можно считать, что молекулярная структура частиц вируса табачной мозаики в основном выяснена. Установлено, что в генетической молекуле РНК у этого вируса содержится 6500 нуклеотидов. Белковая оболочка вируса состоит из 2200 белковых единиц, каждая из которых имеет молекулярный вес 17 500 и построена из 158 аминокислот. Последовательность аминокислот в белках вируса полностью выяснена. Под действием азотистой кислоты на выделенную вирусную РНК появляются изменения в составе нуклеотидов. Мутантная нить РНК возникает при изменении одного азотистого основания среди 5600 имеющихся в молекуле. Такие мутантные молекулы РНК при заражении ими растений размножаются и дают мутантные формы вируса с мутантной нитью РНК и с новым белком.

Азотистая кислота вызывает переход цитозина в урацил (Ц→У), аденина в гипоксантин (А→Гип) и гуанина в ксантин (Г→Кса). Однако при редупликации измененной нити РНК в клетках листа растения ксантин и гипоксантин не воспроизводятся. В новых молекулах на их место становятся притягиваемые из цитоплазмы нуклеотиды, содержащие гуанин. В результате действие азотистой кислоты приводит к замене аденина на гуанин (Г→Г) и цитозина на урацил (Ц→У).

Вполне понятно, что кодовые триплеты, ответственные за программирование белков у вируса табачной мозаики, будут определенным образом изменяться под действием азотистой кислоты. Вслед за этим изменяется и синтез белков.

Анализ синтеза белков в мутантах вируса табачной мозаики позволил установить кодирующие триплеты. Было обнаружено замечательное совпадение данных, полученных при использовании синтетических полимеров и при анализе мутантов у вируса табачной мозаики, вызванных действием азотистой кислоты. Так, например, было показано, что кодом для включения треонина служит триплет УАЦ (урацил — аденин — цитозин). Раскрытие природы кодовых групп в генетической нити нуклеиновых кислот вируса табачной мозаики представляет громадный интерес. Совпадение с данными по синтетическим полимерам имеет большое значение, указывая на универсальность кодовых групп. Главная задача дальнейшей работы — раскрытие сущности кода в ряде групп организмов.

Поразительные достижения биохимической генетики, установившие природу химических структур, при помощи которых 1енетическая информация записана в молекулах нуклеиновых кислот, являются одним из центральных событий во всей науке нашего времени. Так же как открытие расщепления урана привело к овладению атомной энергией, так и расшифровка генетического кода открывает новые пути для разработки методов управления наследственностью и жизнью.

Проблема гена, т. е. формы дискретности в записи генетической информации, становится в центр исследований нового естествознания, усилия которого направлены на разрешение загадки жизни. Овладение методами направленной переделки наследственности и жизни получит свое реальное воплощение лишь после того, как расшифровка кода генетической информации и изменения химических структур, обеспечивающих запись и передачу по поколениям генетической информации, будут осуществлены на живых структурах. Управление дискретной наследственностью организмов требует решения проблемы на молекулярном уровне, преломленном в генной организации генетического материала. Но и этого недостаточно. Необходимо учесть системы организации наследственности и системы организма.

Все это серьезно усложняет проблемы направленного управления жизнью. Однако раскрытие природы молекулярных основ наследственности является настолько поразительным и обнадеживающим успехом, что вся проблема управления наследственностью и жизнью приблизилась к своему осуществлению.

 

Предыдущая глава ::: К содержанию ::: Следующая глава

 

                       

  Рейтинг@Mail.ru    

Внимание! При копировании материалов ссылка на авторов книги обязательна.