big-archive.ru

Большой информационный архив

                       

Биосинтез нуклеиновых кислот

Принцип комплементарности оснований ДНК и их цепей в целом дает возможность объяснить репликации двойной спирали: цепи должны сначала разойтись, а потом каждая из них строит комплементарную себе. В этом случае каждая цепь является как бы шаблоном, матрицей для строительства новой. В результате репликации должно образоваться две совершенно одинаковые молекулы ДНК, каждая из которых содержит одну «старую» и одну вновь синтезированную цепь. Такое предположение было выдвинуто на основании данных о комплементарности цепей, а также радиоавтографического изучения препаратов хромосом после одного клеточного деления. На препаратах было отчетливо видно, что радиоактивная метка содержится не на всей хромосоме, а как бы на одной из ее продольных половин.

Блестящее подтверждение этот тезис получил в опыте Мезельсона — Сталя. Суть эксперимента состоит в том, что каждое основание ДНК содержит два (цитозин и тимин) или четыре атома азота 14N (гуанин и аденйн). Бактерии можно вырастить на среде, в которой вместо легкого 14N будет тяжелый азот — 15N. Через несколько поколении вся ДНК таких бактерий будет «утяжелена» 15N. Если эти бактерии быстро отмыть от тяжелого азота и перенести на среду с легким азотом, то после первого деления ДНК каждой клетки будет состоять из одной легкой и одной тяжелой цепи. После второго деления половина клеток будет иметь ДНК, состоящую только из «легких» цепей, а половина — одну легкую и одну тяжелую цепь. После третьего деления только четвертая часть клеток будет содержать одну тяжелую цепь ДНК и т. д. (рис. 76). При центрифугировании препаратов ДНК, имеющих «легкие» и «тяжелые» цепи при больших скоростях в градиенте плотности хлористого цезия разные молекулы займут разное положение в растворе: ДНК о обеими «тяжелыми» цепями окажется ближе ко дну пробирки, ДНК с обеими «легкими» цепями — ближе к поверхности, а ДНК с одной легкой и одной тяжелой цепью — промежуточное положение, что и подтвердило полуконсервативный характер репликации ДНК. Такой характер репликации ДНК позже был подтвержден и на хромосомах многоклеточных организмов с помощью метода радиоавтографии. Суть метода состоит в том, что при проращивании семян растений в среде с тимидином, меченным радиоактивным изотопом водорода тритием (3Н), последний будет включаться в состав вновь синтезируемых молекул ДНК. Если из первичных корешков проросших семян приготовить цитологические препараты и покрыть их фотографической эмульсией, то после определенной экспозиции и последующего проявления на препаратах можно увидеть засвеченные зерна серебра в виде черных точек. При продолжительном проращивании семян в присутствии 3Н-тимидина можно добиться такого состояния, что все хромосомы делящихся клеток окажутся помеченными. Если затем проростки перенести на среду с немеченым тимидином и готовить радиоавтографические препараты клеток, вступивших в митоз, то после каждого митоза число засвеченных зерен фотоэмульсии над каждой дочерней хромосомой будет уменьшаться. При этом после первого митоза число зерен будет вдвое меньшим исходного, а после второго — одна из каждой пары хромосом вовсе не будет меченой. Следовательно, у исходных хромосом обе хроматиды были мечеными, после первого деления каждая хроматида имела одну «материнскую» молекулу ДНК и одну вновь синтезированную «дочернюю». Первая из них содержит радиоактивный тимидин, вторая лишена его. При втором митозе каждая хроматида

Схема, иллюстрирующая опыт Мезельсона-Сталя

даст две, одна из которых включит радиоактивную «материнскую» молекулу ДНК и вновь синтезированную нерадиоактивную, а вторая — нерадиоактивную «дочернюю» и вновь синтезированную «внучатую», также нерадиоактивную (рис. 77). Поэтому после второго митоза и обнаруживаются немеченые хромосомы. Такой способ репликации ДНК получил название полуконсервативного.

Итак, для того чтобы на одной молекуле ДНК могла синтезироваться вторая такая же молекула, она должна разделиться на составляющие ее нити двойной спирали, т. е. деспирализоваться и расплестись. Однако расплестись гигантской молекуле, состоящей из многих миллионов пар нуклеотидов, образующих миллионы витков спирали, не так просто. Даже если скорость синтеза ДНК принять равной 1000 нуклеотидов в секунду (для ДНК фага Т4 она равна 900 нуклеотидам в секунду, а для более сложно организованных форм существенно выше),

Авторадиографическое доказательство полуконсервативного механизма репликации ДНК

скорость вращения нитей ДНК при расплетании должна составлять десятки тысяч оборотов в минуту. При этом ДНК должна не просто расплетаться, но и одновременно синтезировать новые нити. Нетрудно представить нереальность такого процесса. В действительности было установлено, что линейные молекулы ДНК реплицируются не целиком, а частями, образуя фрагменты, названные по имени открывшего их

Схема репликации ДНК с образованием фрагментов Оказаки

японского ученого фрагментами Оказаки. Такие фрагменты удерживаются на матричных нитях молекул ДНК сначала за счет водородных связей, а также сил, возникающих между азотистыми основаниями в цепи (так называемые стекинг-взаимодействия), а затем молекулы вновь синтезированной ДНК стабилизируются в результате сшивки отдельных фрагментов Оказаки с помощью фермента полинуклеотидлигазы (рис. 78). Процесс репликации ДНК — ферментативный процесс. В.рассмотренном случае необходимо участие нескольких ферментов. На первом этапе молекула ДНК должна получить однонитевые разрывы, которые образуются с помощью фермента эндонуклеазы. На разорванный участок садится две молекулы фермента ДНК-полимеразы, каждая из которых, расплетая ДНК, осуществляет синтез новых нитей в противоположных направлениях (от 5-го атома углерода дезоксирибозы к 3-му атому), поскольку, как уже известно, нити ДНК антипараллельны. На заключительном этапе вступает в действие уже упоминавшаяся полинуклеотидлигаза. Конечно, процесс репликации ДНК изложен здесь схематично, но вместе с тем эта схема довольно точно описывает реально происходящие в клетке события.

Схема репликации ДНК по механизму "катящегося обруча"

Существенно иначе реплицируются кольцевые молекулы ДНК, хотя в процессе участвуют те же ферменты. На первом этапе кольцевая молекула ДНК надрезается эндонуклеазой и образовавшийся 5'-й конец разрезанной нити прикрепляется к клеточной мембране. С этого конца ДНК-полимераза ведет синтез новой цепи, одновременно раскручивая кольцо, шаг за шагом освобождая новые нуклеотиды. На непрерывно растущей двуспиральной молекуле ДНК специфическая эндонуклеаза нарезает фрагменты ДНК с липкими (комплементарными) концами, равные по длине молекулам исходной ДНК. На заключительном этапе вновь синтезированные молекулы ДНК замыкаются по комплементарным концам и сшиваются полинуклеотидлигазой. Эта модель, предложенная Дж. Уотсоном, получила название модели «катящегося обруча» (рис. 79).

 

Предыдущая глава ::: К содержанию ::: Следующая глава

 

                       

  Рейтинг@Mail.ru    

Внимание! При копировании материалов ссылка на авторов книги обязательна.